彭 濤，劉永剛，李 琴

（云南九洲醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，昆明 650000）

IVF（體外受精）實(shí)驗(yàn)室是輔助生殖技術(shù)（assisted reproductive technology，ART）能否順利實(shí)施的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，是產(chǎn)生胚胎的重要場所，直接決定患者接受輔助生殖技術(shù)后的結(jié)局。近年來，雖然胚胎體外培養(yǎng)技術(shù)得到了長足發(fā)展，但體外培養(yǎng)仍然無法完全模擬體內(nèi)生長環(huán)境，胚胎實(shí)驗(yàn)室實(shí)行嚴(yán)格的質(zhì)量控制和質(zhì)量保證體系，不但有利于構(gòu)建穩(wěn)定的培養(yǎng)環(huán)境，而且有助于分析對胚胎培養(yǎng)造成影響的因素。因此，在培養(yǎng)人類胚胎前需要檢測實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境以確定該實(shí)驗(yàn)室是否符合使用條件，檢測培養(yǎng)箱的各參數(shù)以確定能否成功開展胚胎培養(yǎng)。最后使用科學(xué)的方法對實(shí)驗(yàn)室、儀器設(shè)備、人員操作進(jìn)行綜合評估。而對此綜合評估的檢測方法通常有體外培養(yǎng)鼠胚生物學(xué)實(shí)驗(yàn)（mouse embryo assay，MEA）和人精子體外存活實(shí)驗(yàn)（human spermmotility assay，HSMA）。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物SPF級昆明種小鼠購自昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，動物合格證SCXK（滇）2015-0002。雌鼠：18只，6～8周齡，體質(zhì)量25～28 g；雄鼠：8只，8～10周齡，體質(zhì)量33～35 g。適應(yīng)性喂養(yǎng)3～5 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2主要藥品與試劑孕馬血清促性腺激素（PMSG，寧波三生生物制品公司）；人絨毛膜促性腺激素（HCG，麗珠醫(yī)藥集團(tuán)公司）；精子梯度分離液（Sperm Grad），洗精受精液（G-ivf plus），卵子收集液（G-mops plus），卵裂培養(yǎng)液（G-1 plus），囊胚培養(yǎng)液（G-2 plus），胚胎培養(yǎng)礦物油均為瑞典Vitrolife培養(yǎng)液系列（瑞典Vitrolife公司）。

1.3設(shè)備與耗材IVF實(shí)驗(yàn)室設(shè)備包括日本Nikon SMZ解剖顯微鏡；Nikon Ti倒置顯微鏡；日本Astec培養(yǎng)箱；美國Thermo 3111培養(yǎng)箱；VWR培養(yǎng)箱專用溫度計(jì)；丹麥K-system Daul-126工作站；Epoc血?dú)夥治鰞x；英國G－100 CO2濃度測定儀等。培養(yǎng)皿、試管等耗材均為美國BD Falcon公司產(chǎn)品，一次性使用。

1.4方法

1.4.1 實(shí)驗(yàn)室及培養(yǎng)箱的質(zhì)控 實(shí)驗(yàn)室白天清水擦洗墻面和地面，加熱后開門，大功率抽風(fēng)機(jī)通風(fēng)，夜間開啟層流通風(fēng)，連續(xù)處理3個月〔1〕。新到培養(yǎng)箱使用專用消毒液擦洗后，用滅菌純水擦洗3遍進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室。培養(yǎng)箱內(nèi)水盤不加水開機(jī)設(shè)置37℃，不通氣熱處理1個月，此期間每日開門2次換氣。1個月后水盤加水通CO2氣體（純度99.99%），設(shè)定參數(shù)。每日早晚測溫度和CO2濃度，培養(yǎng)箱穩(wěn)定后用血?dú)夥治鰞x檢測洗精受精液、卵裂培養(yǎng)液、囊胚培養(yǎng)液的pH值。

1.4.2 人精子體外存活實(shí)驗(yàn) 選擇20～35歲身體健康的男性患者精液，排除傳染性疾病。精液標(biāo)準(zhǔn)：液化時間20～30 min，精子密度＞20×106個/mL，PR（前向移動比率）＞32%，正常形態(tài)精子＞4%〔2〕。用精子梯度分離液和洗精受精液配制成高濃度梯度（90%）、低濃度梯度（45%）離心液。采用非連續(xù)密度梯度離心法處理精子，收集處理后精子到試管中，并調(diào)整活動精子的密度至5×106個/mL。從試管中取0.5 mL處理后的精子于標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)管中進(jìn)行精子存活實(shí)驗(yàn)。將上述培養(yǎng)管置于培養(yǎng)箱25℃培養(yǎng)、對照管置于室溫下培養(yǎng)。分別在24、48、72 h后搖勻精子懸液，移液器吸取5μL精子懸液滴在MAKLER板計(jì)數(shù)精子的活動率（100%減去觀察100個方格內(nèi)的不活動精子占總精子數(shù)的百分率），同樣方法計(jì)數(shù)3次，求精子活動率的平均值，然后計(jì)算存活指數(shù)（sperm motility index，SMI），SMI=測試管中向前活動精子比率/對照管中向前活動精子比率〔3〕。

1.4.3 鼠胚實(shí)驗(yàn)雌鼠促排卵 小鼠購回后適應(yīng)飼養(yǎng)3～5 d，選雌鼠4～5只，下午6點(diǎn)腹腔注射PMSG 10 IU/只，48 h后腹腔注射HCG 10 IU/只，注射HCG 14 h后以頸椎脫臼法處死雌鼠，腹腔表面消毒，打開腹腔，分離卵巢與輸卵管，將輸卵管放于裝有3 mL卵子收集液的預(yù)熱3001培養(yǎng)皿中傳至實(shí)驗(yàn)室。

1.4.4 鼠卵的采集 在體視鏡下找到培養(yǎng)皿中的輸卵管，用1 mL注射器劃破輸卵管壺腹部，釋放卵丘冠復(fù)合體（OCCC），在卵子收集液中，用巴斯德管將OCCC移至新的培養(yǎng)皿中吸吹洗滌2次后放置于受精皿的液滴中待用，受精皿預(yù)先在3001培養(yǎng)皿中做4個80μL受精液滴覆蓋培養(yǎng)油，于37℃、7%CO2濃度培養(yǎng)箱中過夜平衡。

1.4.5 鼠精的采集 小鼠購回后適應(yīng)飼養(yǎng)3～5 d，于取鼠卵日上午9點(diǎn)將雄鼠以頸椎脫臼法處死，腹部表面消毒，打開腹腔，取出形似火柴的附睪，去掉脂肪，將附睪放于裝有3 mL洗精受精液的預(yù)熱3001培養(yǎng)皿中，用1 mL注射器劃開附睪尾部并擠壓，擠出精子團(tuán)，用巴斯德管吸出精子團(tuán)，放入2 mL洗精受精液中，于37℃、7%CO2濃度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min完成獲能。

1.4.6 常規(guī)IVF 收集上層霧狀精子懸液進(jìn)行計(jì)數(shù)，上午10點(diǎn)按卵：精=1：1萬將精子懸液加至含卵子的受精皿液滴中開始受精，6～8 h后觀察受精情況。

1.4.7 卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射（ICSI） 將獲得的精子置于37℃、7%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h后，在透明質(zhì)酸酶中用巴斯德管反復(fù)吹吸OCCC脫去周圍顆粒細(xì)胞，挑選減數(shù)分裂中期Ⅱ（MⅡ）卵子放入預(yù)備好的卵子收集液滴中，將活動精子置于7%的聚乙烯吡咯烷酮（PVP）中，經(jīng)尾部制動后，僅將頭先吸入顯微注射針內(nèi)，頸部留在針口，尾部留在針外，將精子在持卵針上蹭掉頸和尾部，顯微注射針內(nèi)只留精子頭部，用持卵針固定卵子，保持卵極體位于6點(diǎn)或12點(diǎn)位置，注射針于卵子3點(diǎn)位置進(jìn)針，刺破卵胞膜后回吸少量胞質(zhì)，然后將精子頭部注入卵細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)，用巴斯德管將完成注射的卵子轉(zhuǎn)入胚胎培養(yǎng)液滴。完成注射6～8 h后，倒置顯微鏡下觀察受精情況（雌雄原核出現(xiàn)為受精的標(biāo)志），并將受精卵轉(zhuǎn)移至在37℃、7%CO2中平衡過的卵裂培養(yǎng)液滴中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4.8 胚胎觀察 受精后6～8 h觀察：受精卵；20 h觀察：2細(xì)胞胚胎形成；60～70 h觀察：胚胎致密化；90 h觀察：囊胚形成；5 d觀察：囊胚部分與完全擴(kuò)張。記錄觀察數(shù)據(jù)〔4〕。

2 結(jié)果

2.1實(shí)驗(yàn)室處理完畢后環(huán)境檢測在新裝修實(shí)驗(yàn)室VOC（揮發(fā)性有機(jī)化合物）的主要有害成分可能以甲醛為主，其次是苯系化合物，它們是室內(nèi)毒性最大的VOC〔5〕。實(shí)驗(yàn)室通過加熱排風(fēng)透氣后檢測環(huán)境中的VOC指標(biāo)，參照《潔凈手術(shù)部建筑技術(shù)規(guī)范GB50333》符合使用標(biāo)準(zhǔn)，證明實(shí)驗(yàn)室可以使用。見表1。

表1 胚胎實(shí)驗(yàn)室環(huán)境檢測結(jié)果

2.2培養(yǎng)箱中pH值檢測平衡16 h洗精受精液pH值、卵裂培養(yǎng)液pH值、囊胚培養(yǎng)液pH值使用Epoc血?dú)夥治鰞x測定，確定培養(yǎng)箱設(shè)定的CO2濃度為7%（昆明海拔1 800 m）適宜培養(yǎng)。見表2。

表2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)液pH值檢測結(jié)果

2.3人精子體外存活實(shí)驗(yàn)結(jié)果在實(shí)際計(jì)數(shù)精子活率時，由于精子密度低，常規(guī)的計(jì)數(shù)精子方法容易受偶然因素影響，所以在計(jì)數(shù)時采取的方法是：先觀察并記錄在MAKLER板上100個方格內(nèi)的精子總數(shù)，再單獨(dú)觀察記錄100個方格內(nèi)不動精子數(shù)，最后兩數(shù)相減得到活動精子數(shù)，再用活動精子數(shù)除以總精子數(shù)得出精子活率，然后計(jì)算存活指數(shù)，最后得出結(jié)果。結(jié)果培養(yǎng)箱中和實(shí)驗(yàn)室中的精子存活指數(shù)≥95%，培養(yǎng)箱處理合格。見表3。

表3 精子在培養(yǎng)箱和培養(yǎng)室中的活率及存活指數(shù)

2.4鼠胚實(shí)驗(yàn)結(jié)果共進(jìn)行了4批次鼠胚實(shí)驗(yàn)，精卵共培養(yǎng)6～8 h后“拆蛋”觀察雌雄原核，即受精卵。見圖1。體外受精率平均80.9%，可能操作鼠精子過程中，由于鼠精子尾部較長影響精子的活力。鼠受精卵發(fā)育到2細(xì)胞階段胚胎的平均卵裂率是97.6%，形態(tài)見圖2。隨后發(fā)育到致密化胚胎，最后發(fā)育成囊胚。見圖3～4。囊胚的形成率平均87.1%，表明生殖實(shí)驗(yàn)室設(shè)備和人員操作達(dá)到正式運(yùn)行標(biāo)準(zhǔn)。見表4。

圖1 鼠受精卵

圖2 發(fā)育到2細(xì)胞階段鼠胚胎

圖3 鼠致密化胚胎

圖4 鼠囊胚

表4 體外鼠胚實(shí)驗(yàn)的參數(shù)

3 討論

新建立的實(shí)驗(yàn)室一定嚴(yán)格按時序依次對VOC、溫度、濕度、培養(yǎng)箱等實(shí)施質(zhì)量控制。根據(jù)所在地氣候、海拔等條件因地制宜采取實(shí)驗(yàn)質(zhì)量控制方式。首先實(shí)驗(yàn)室空氣質(zhì)量難以控制，卻是開展工作的首要條件?？諝庵蠽OC可導(dǎo)致受精失敗或者胚胎發(fā)育延遲及降低發(fā)育潛能等，而且這種影響不易直觀發(fā)現(xiàn)，另外還會進(jìn)入培養(yǎng)箱造成二次影響。其次，培養(yǎng)箱中空氣質(zhì)量可受實(shí)驗(yàn)室內(nèi)、管道供氣影響。培養(yǎng)箱使用經(jīng)過質(zhì)量認(rèn)證的氣體純度99.99%，外接氣體濾器Coda，有效保護(hù)培養(yǎng)環(huán)境〔6〕。實(shí)驗(yàn)室的空氣雖然經(jīng)過高效過濾膜（HEPA）過濾，但是新HEPA在生產(chǎn)及包裝運(yùn)輸中不可避免地會攜帶VOC，另外IVF實(shí)驗(yàn)室的高效層流（HEPA）設(shè)備雖然可以部分換氣及過濾空氣中的塵埃粒子，但是單純的HEPA層流在正壓的條件下不能有效去除室內(nèi)VOC〔7-8〕。因此，每次更換HEPA前應(yīng)對HEPA進(jìn)行熱處理，更換后由專業(yè)測試機(jī)構(gòu)檢測實(shí)驗(yàn)室懸浮粒子及空氣質(zhì)量，合格后繼續(xù)使用。然后，每日檢測實(shí)驗(yàn)室的溫度、濕度、培養(yǎng)箱的CO2濃度，保證實(shí)驗(yàn)室處于穩(wěn)定的條件下。新建實(shí)驗(yàn)室的培養(yǎng)箱設(shè)置時要根據(jù)培養(yǎng)液平衡后實(shí)測的pH值反推設(shè)置CO2濃度。最后，在以上穩(wěn)定、適宜的工作條件下實(shí)驗(yàn)室開始對試劑、耗材及人員操作實(shí)施質(zhì)量控制，方法是人精子存活實(shí)驗(yàn)和小鼠體外受精實(shí)驗(yàn)。

人精子存活實(shí)驗(yàn)已被證實(shí)是一種對生殖實(shí)驗(yàn)室低水平毒性敏感性檢測的有效方法，對實(shí)驗(yàn)室單個因素的檢測有效，現(xiàn)在大多數(shù)的生殖中心均采用人精子存活實(shí)驗(yàn)作為IVF實(shí)驗(yàn)室專一檢測培養(yǎng)環(huán)境和常用試劑、耗材質(zhì)量控制的手段。由于要連續(xù)觀察72 h，在操作過程中要注意精子放置穩(wěn)定及避免人為操作影響，比如滴加精子在MAKLER板前搖勻，切忌吹打混勻，否則嚴(yán)重影響精子活力。

小鼠體外受精技術(shù)適用于包括實(shí)驗(yàn)室環(huán)境、培養(yǎng)箱、試劑、耗材及人員操作水平等復(fù)合條件的檢驗(yàn)。在訓(xùn)練新技術(shù)人員實(shí)施ICSI操作中注意，鼠精子的尾部較長，鼠精子的斷尾操作和人精子制動是不同的，訓(xùn)練時要注意區(qū)別。體外鼠胚試驗(yàn)的主要判定依據(jù)為囊胚形成率和囊胚質(zhì)量〔9〕。小鼠胚胎與人胚胎有幾乎相同的發(fā)育經(jīng)歷，因此小鼠體外受精胚胎的整個操作過程可以成為人類生殖實(shí)驗(yàn)室的模型，而且可以磨練操作人員技術(shù)，為今后開展人類輔助生殖技術(shù)奠定良好的基礎(chǔ)。

生殖實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制體系是系統(tǒng)工程，有其先后順序及連續(xù)性，嚴(yán)格實(shí)施質(zhì)量控制目的是為了保證實(shí)驗(yàn)室不出現(xiàn)大的波動，獲得穩(wěn)定的成功率。本實(shí)驗(yàn)室2015年體外培養(yǎng)鼠胚實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證合格后于當(dāng)年獲得衛(wèi)健委專家評審準(zhǔn)入資格，2018年完成兩千余例，臨床妊娠率達(dá)到60%以上。