韓艷軍，王翠麗，劉小虎，周 玥

（大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理 671000）

白血病是一種造血系統(tǒng)的惡性腫瘤，目前化療是治療白血病的主要手段，但化療藥物的副作用大，復(fù)發(fā)率高，對人體機(jī)能有極大的損害。某些天然藥物具有抗白血病細(xì)胞而對正常細(xì)胞損傷小的優(yōu)點(diǎn)，因此，從祖國醫(yī)學(xué)寶庫中尋找抑制白血病細(xì)胞惡性增殖的中藥是值得探索的途徑之一〔1〕。人參為五加科植物人參（Panax ginseng C.A.Mey.）的干燥根和莖，收載于《中華人民共和國藥典》，性微溫，味甘、微苦，歸脾、肺、心經(jīng)，具有大補(bǔ)元?dú)?、?fù)脈固脫、補(bǔ)脾益肺、生津養(yǎng)血、安神益智之功效，人參對白血病有一定的療效〔2〕。其中人參皂苷Rg1是人參的主要藥理活性成分〔3〕，對腫瘤細(xì)胞的增殖有明顯抑制作用并能誘導(dǎo)其分化〔4〕。本實(shí)驗(yàn)以慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株K562為研究對象，探討人參皂苷Rg1對K562細(xì)胞增殖的影響，并篩選出人參皂苷Rg1對K562最佳的作用時間及濃度，為后續(xù)研究人參皂苷Rg1在治療白血病中起到的作用及相關(guān)機(jī)制提供研究思路和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與儀器

1.1實(shí)驗(yàn)材料與試劑K562細(xì)胞購自齊式生物科技有限公司；RPMI 1640培養(yǎng)基（HyClone公司）；胎牛血清（BI公司）；PBS（磷酸緩沖鹽溶液，賽默飛公司）；PI（碘化丙啶，BD公司）；人參皂苷Rg1（大連美侖生物有限公司）；CCK-8試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司）；細(xì)胞周期與凋亡檢測試劑盒（美國BD公司）；96孔板和24孔板（COSTAR公司）。

1.2實(shí)驗(yàn)儀器電熱壓力蒸汽消毒器（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司）；超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；二氧化碳培養(yǎng)箱（日本三洋sanyo）；低速臺式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；多功能酶標(biāo)儀（Thermo Fisher）；流式細(xì)胞儀（美國BD公司）；倒置顯微鏡（Nikon）；移液器（Eppendorf）；細(xì)胞計數(shù)板（上海醫(yī)用儀器廠）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)用RPMI 1640培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）于37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)K562細(xì)胞，每天更換培養(yǎng)液，每隔2～3 d傳代并凍存，取對數(shù)生長期的K562細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 K562細(xì)胞增殖取對數(shù)生長期的K562細(xì)胞，按1×105個/mL的濃度接種于96孔板中，每孔100μL。分別加入不同濃度（5、10、20、40、80μmol/L）的人參皂苷Rg1，每孔10μL，每個濃度設(shè)5個復(fù)孔。另設(shè)空白對照組（不加藥物）。置于37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。分別培養(yǎng)24、48和72 h后，加入CCK-8，每孔10μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，經(jīng)酶標(biāo)儀檢測A450值，并按下式計算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率（%）=［（空白對照組A450平均值-各實(shí)驗(yàn)組A450平均值）/空白對照組A450平均值］×100%，該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.3 K562細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)取對數(shù)生長期的K562細(xì)胞，按500個/mL的濃度接種于24孔板中，每孔500μL。分別加入不同濃度（5、10、20、40、80 μmol/L）的人參皂苷Rg1，每孔50μL，每個濃度設(shè)4個復(fù)孔。另設(shè)空白對照組（不加藥物）。置于37℃、5%CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)7 d后記錄K562白血病細(xì)胞集落數(shù)，并計算集落形成率和抑制率。細(xì)胞集落形成率（%）=平均細(xì)胞集落數(shù)/每孔中加入的細(xì)胞數(shù)×100%，抑制率（%）=［（空白對照組集落數(shù)-實(shí)驗(yàn)組集落數(shù)）/空白對照組集落數(shù)］×100%，以大于50個細(xì)胞的聚合為一個K562細(xì)胞集落。該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4 K562細(xì)胞周期檢測取對數(shù)生長期的K562細(xì)胞，按1×105個/mL的濃度分別接種于兩個培養(yǎng)瓶中，每瓶5 mL，分別標(biāo)記為空白對照組和人參皂苷Rg1組。在空白對照組和人參皂苷Rg1組中分別加入PBS和20μmol/L的人參皂苷Rg1，每瓶500μL。處理細(xì)胞48 h后，離心收集細(xì)胞，棄上清，預(yù)冷PBS洗滌3次，加入1 mL預(yù)冷70%乙醇混勻，在4℃下固定過夜，離心收集細(xì)胞，洗滌，用PBS重懸細(xì)胞。加入PI染色液，每組500μL，37℃避光溫浴30 min。最后在激發(fā)波長為488 nm處上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.5數(shù)據(jù)處理采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以（）表示，實(shí)驗(yàn)組與空白對照組比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），方差齊時進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-q檢驗(yàn)，方差不齊時用Dennett's檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1人參皂苷Rg1對K562細(xì)胞增殖的影響經(jīng)過人參皂苷Rg1分別處理24、48、72 h后，5、10、20、40、80μmol/L的人參皂苷Rg1處理組對K562細(xì)胞的抑制率分別見表1。當(dāng)人參皂苷Rg1濃度為20μmol/L，作用時間為48 h時K562細(xì)胞增殖抑制率最高，為（24.5±0.2）%。

表1 人參皂苷Rg1對K562細(xì)胞增殖的影響

表1 人參皂苷Rg1對K562細(xì)胞增殖的影響

注：與空白對照組比較*P＜0.001。

3.2人參皂苷Rg1對K562細(xì)胞集落的影響經(jīng)過濃度為5、10、20、40、80μmol/L的人參皂苷Rg1分別處理，培養(yǎng)7 d后K562細(xì)胞的集落數(shù)、集落形成率、集落抑制率分別見表2。當(dāng)人參皂苷Rg1濃度為20μmol/L，K562細(xì)胞的集落數(shù)最少，為（354.0±6.2）個；集落形成率最低，為（70.8±1.2）%；集落抑制率最高，為（22.7±1.5）%。集落圖像見圖1。

3.3人參皂苷Rg1對K562細(xì)胞周期的影響經(jīng)過濃度為20μmol/L的人參皂苷Rg1處理48 h后，細(xì)胞周期的改變見表3。與空白對照組比較，加藥組細(xì)胞周期發(fā)生明顯改變，阻滯在G0/G1期的細(xì)胞變多，為（76.3±2.6）%；S期和G2/M期的細(xì)胞變少，分別為（8.3±1.4）%和（15.4±1.5）%。細(xì)胞周期流式圖見圖2。

圖1 集落圖像（×100）

表2 人參皂苷Rg1對K562細(xì)胞集落的影響s，n=3）

表2 人參皂苷Rg1對K562細(xì)胞集落的影響s，n=3）

注：與空白對照組比較*P＜0.05，**P＜0.001。

表3 人參皂苷Rg1對K562細(xì)胞周期的影響±s，n=3）

表3 人參皂苷Rg1對K562細(xì)胞周期的影響±s，n=3）

注：與空白對照組比較*P＜0.05，**P＜0.001。

4 討論

圖2 細(xì)胞周期流式圖（PI染色）

K562細(xì)胞是人類慢性髓系白血病細(xì)胞，常常用于研究腫瘤和白血病的治療及探尋藥物靶標(biāo)等領(lǐng)域。慢性粒細(xì)胞白血?。╟hronic myelogenous leukemia，CML）是一類由造血干細(xì)胞惡性克隆形成的疾病，白血病細(xì)胞因自我更新增強(qiáng)、增殖失控、分化障礙及凋亡受阻而停滯在細(xì)胞發(fā)育的不同階段，增殖失控是其典型特征，從而使正常造血功能受到抑制并逐漸浸潤骨髓及其臨近組織，最終導(dǎo)致骨髓造血功能受損，白血病是一類造血干細(xì)胞的惡性克隆性疾病〔5-6〕。CML的傳統(tǒng)治療包括化療和骨髓移植，兩者都給患者帶來了相當(dāng)大的經(jīng)濟(jì)和心理負(fù)擔(dān)，化療副作用強(qiáng)，特異性差，而骨髓移植供體稀少，價格昂貴。因此，繼續(xù)研究CML的新型治療方法非常重要〔7-8〕。

人參皂苷Rg1可在一定濃度范圍內(nèi)呈劑量-效應(yīng)關(guān)系的抑制K562細(xì)胞增殖，以作用48 h時抑制作用最強(qiáng)〔9〕。研究報道，40μg/mL的人參皂苷Rg1處理MG-63人骨肉瘤細(xì)胞后細(xì)胞增殖抑制率最高〔10〕，50μmol/L的人參皂苷Rg1處理HL-60細(xì)胞后細(xì)胞增殖抑制率最高〔11〕。由此可知，人參皂苷Rg1對不同細(xì)胞株增殖抑制的最適濃度不同。本研究對人參皂苷Rg1進(jìn)行了體外抗腫瘤活性的初步研究，結(jié)果顯示：人參皂苷Rg1濃度為20μmol/L時，作用48 h，對K562細(xì)胞的增殖抑制作用最明顯，K562細(xì)胞的集落數(shù)最少，集落形成率最低，集落抑制率最高。集落數(shù)目的多少取決于細(xì)胞的活力強(qiáng)弱，集落形成率降低意味著細(xì)胞活力的減弱。本研究中人參皂苷抑制K562細(xì)胞增殖，降低細(xì)胞的活力，使得細(xì)胞集落形成減少。CCK-8法的主要研究對象是細(xì)胞群，而集落形成實(shí)驗(yàn)的主要研究對象是原始細(xì)胞，因此，CCK-8法與集落形成實(shí)驗(yàn)相結(jié)合能夠更全面、更客觀地觀察和分析人參皂苷Rg1對K562細(xì)胞增殖的抑制作用。說明人參皂苷Rg1能夠抑制K562細(xì)胞增殖，具有體外抗腫瘤活性。

細(xì)胞增殖通常與細(xì)胞周期密不可分，細(xì)胞增殖是通過細(xì)胞周期的正常運(yùn)行來實(shí)現(xiàn)的。有研究表明，細(xì)胞周期變化與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)〔12〕。正常細(xì)胞周期中存在周期調(diào)節(jié)控制點(diǎn)，而癌細(xì)胞可以無限增殖正是由于癌細(xì)胞對周期控制點(diǎn)的調(diào)節(jié)失去了控制，如果藥物能恢復(fù)周期控制點(diǎn)的作用，導(dǎo)致細(xì)胞不能得到增殖，就能達(dá)到抑制癌細(xì)胞增殖的作用〔13〕。其中G1期已經(jīng)成為多種抗腫瘤藥物的作用靶點(diǎn)〔9〕。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示K562細(xì)胞周期發(fā)生明顯改變，阻滯在G0/G1期的細(xì)胞變多，S期和G2/M期的細(xì)胞變少。G0/G1期時細(xì)胞為不再增殖細(xì)胞，對腫瘤增長沒有作用，阻滯在該期的細(xì)胞所占數(shù)量越多，腫瘤的惡性程度越低，細(xì)胞的增殖變慢〔14〕。由此可知人參皂苷Rg1可能起到了恢復(fù)周期調(diào)節(jié)控制點(diǎn)的作用，通過將K562細(xì)胞阻滯在G0/G1期，破壞細(xì)胞周期，降低腫瘤惡性程度，來抑制細(xì)胞增殖。

白血病的出現(xiàn)是由于多種基因的非正常表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡抑制與過速增殖。因此，探索臨床治療白血病的方法多通過控制和預(yù)防癌細(xì)胞的過速增殖及加速其凋亡來實(shí)現(xiàn)。本文通過探討人參皂苷Rg1對K562細(xì)胞增殖的作用，得出人參皂苷Rg1可能通過將K562細(xì)胞阻滯在G0/G1期來抑制細(xì)胞增殖的結(jié)論。為進(jìn)一步探討人參皂苷Rg1在白血病中起到的生物學(xué)作用、潛在靶點(diǎn)及相關(guān)機(jī)制提供數(shù)據(jù)，奠定理論基礎(chǔ)。但是人參皂苷Rg1可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期抑制K562增殖的具體機(jī)制及信號通路目前尚不清楚，還有待進(jìn)一步研究與闡明。