趙陽 游元丁 冉茂乾

摘要 [目的]通過樣品的分離鑒定，提升檢測能力，確保檢測結(jié)果的真實性和可靠性，增加檢測經(jīng)驗。[方法]根據(jù)樣品指導書和標準GB 4789.5—2012，分離編號分別為19-A766和19-A835的2個測量審核樣品，并進行生化鑒定和血清學鑒定，同時使用全自動微生物鑒定儀（VETEK 2 COMPACT）進行確認。[結(jié)果] 19-A835 25 mL樣品中未檢出志賀氏菌，19-A766 25 mL樣品中檢出志賀氏菌;測量審核結(jié)果為滿意結(jié)果。[結(jié)論]此次測量審核結(jié)果豐富了檢測人員的檢測經(jīng)驗，提高了檢測能力，為進一步完善食品檢測工作打下堅實基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 志賀氏菌;測量審核;檢測能力;分離;鑒定

Abstract [Objective]Through the separation and identification of samples， improve the detection ability， ensure the authenticity and reliability of the test results， and increase the testing experience.[Method]The separated samples （named as 19A766 and 19A835） were identified using biochemistry and serology methods， and validated using a fully automated microbiome （VETEK 2 COMPACT） according to the sample instructions and standard GB 4789.5-2012. [Result]The Shigella was detected in 19A766 （25 ml） samples， but not in 19-A835 （25 mL） samples. The measurement audit results were regarded as satisfaction. [Conclusion]Our analysis enriches the experience and increases the ability of inspectors， which may provide a solid foundation for further food testing.

Key words Shigella;Measurement review;Test ability;Isolation;Identification

《能力驗證規(guī)則》（CNAS-RL02：2018）[1]定義能力驗證是利用實驗室間比對，按照預先制定的準則評價參加者的能力。測量審核（measurement audit）是能力驗證計劃的一種，有時也稱為“一對一”的能力驗證計劃，是實驗室對被測物品（材料或制品）進行實際測試，將測量結(jié)果與參考值進行比較的活動。測量結(jié)果的滿意度是判定實驗室開展或校準該項目能力的標準，是能力驗證計劃的有效補充，也是中國合格評定國家認可委員會（China national accreditation service for conformity assessment， CNAS）判定實驗室能力的重要技術(shù)依據(jù)[1-2]。

志賀氏菌屬（Shigella）是一類具有高度傳染性和嚴重危害性的革蘭氏陰性腸道致病菌，是細菌性痢疾的病原菌，臨床感染可導致痢疾，其癥狀以發(fā)熱、脫水和便血為特征，其在自然界中分布較為廣泛，對人類和動物健康造成嚴重的影響。志賀桿菌屬分為4群：痢疾志賀氏菌、福氏志賀氏菌、鮑氏志賀氏菌、宋內(nèi)氏志賀氏菌[3-4]。據(jù)世界衛(wèi)生組織報道，由志賀氏菌引起的腸道感染病例全球每年約有1.2億，造成死亡的有60多萬[5]。在我國食源性致病菌中，志賀氏菌感染導致的痢疾病例占細菌性痢疾病例的8.5%[6]。引起志賀氏菌感染的食品主要有奶和奶制品、生的蔬菜、水果、沙拉、土豆、禽肉（魚肉、雞肉、蝦）、面包制品等，幾乎涵蓋了人們?nèi)粘κ称返幕拘枨?。因此，提高檢測人員對志賀氏菌檢測能力極為重要。

筆者通過國家檢測標準中傳統(tǒng)的檢測方法[7]，對中國檢驗檢疫科學研究院測試評價中心提供的測量審核樣進行檢測，以達到提升檢測人員檢測素質(zhì)和能力的目的。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品信息。樣品購自中國檢驗檢疫科學研究院測試評價中心，編號分別為19-A766和19-A835。

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑。志賀氏菌增菌肉湯、木糖賴氨酸脫氧膽鹽（XLD）瓊脂、麥康凱瓊脂（MAC）、志賀氏菌顯色培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂（NA）、志賀氏菌干制生化鑒定試劑盒等均購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司;VITEK2革蘭氏陰性細菌鑒定卡購自生物梅里埃公司;志賀氏菌全套診斷血清購自天津生物芯片技術(shù)有限公司。所有培養(yǎng)基和試劑均驗證合格且在有效期內(nèi)。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品處理。樣品性狀為白色凍干塊狀，包裝于真空西林瓶內(nèi)，按樣品說明準備待測樣品原液。

1.2.2 增菌。在生物安全柜內(nèi)以無菌操作取檢樣25 mL加入裝有滅菌的225 mL志賀氏菌增菌肉湯的培養(yǎng)瓶中，將培養(yǎng)瓶放置于密封盒（已放入?yún)捬醍a(chǎn)氣袋和氧氣指示劑）內(nèi)，于（41.5±1.0）℃，厭氧培養(yǎng)16～20 h。增菌結(jié)果如表1所示。

1.2.3 分離。取增菌后的志賀氏增菌液分別劃線接種于XLD瓊脂、MAC瓊脂和志賀氏菌顯色培養(yǎng)基上，于（36±1）℃培養(yǎng)20～24 h，觀察各個平板上生長的菌落形態(tài)并記錄。若出現(xiàn)的菌落不典型或菌落較小不易觀察，則繼續(xù)培養(yǎng)至48 h再進行觀察。

1.2.4 生化試驗。選取“1.2.3”中選擇性瓊脂平板上符合志賀氏菌菌落特征的平板，從平板上挑取菌落轉(zhuǎn)移至營養(yǎng)瓊脂平板，于（36±1）℃培養(yǎng)24 h。同時采用志賀氏菌干制生化鑒定試劑盒和全自動微生物鑒定儀（VITEK 2 COMPACT）進行鑒定。根據(jù)志賀氏菌生化試劑盒使用說明書，挑取新鮮培養(yǎng)的單個菌落接種三塘鐵與半固體瓊脂生化管，同時用接種環(huán)挑取同一菌落至適量0.85%無菌生理鹽水中，制成0.5麥氏濁度的均一菌懸液;將菌懸液按每孔0.2 mL接種量加入試劑盒的圓孔中，按照說明書相應(yīng)添加無菌液體石蠟，蓋上蓋盒，與三塘鐵和半固體瓊脂生化管一同于（36±1）℃培養(yǎng)，綿子糖試驗若24 h仍為陰性，可延長培養(yǎng)至48 h再觀察結(jié)果[8]。全自動微生物鑒定儀鑒定方法：在麥氏比濁管內(nèi)加入3 mL 0.45%的無菌生理鹽水，挑取營養(yǎng)瓊脂純培養(yǎng)的單菌落制成0.50～0.63個麥氏濁度的均勻菌懸液，按儀器作業(yè)指導書進行上機鑒定。

1.2.5 血清學鑒定。將潔凈載玻片分為2個區(qū)域，標記為血清試驗組和對照組，挑取一環(huán)純培養(yǎng)待測單菌落，各放1/2環(huán)于玻片上的每一區(qū)域的上部，在血清試驗組滴加1滴抗血清，對照組滴加1滴生理鹽水。再用無菌接種環(huán)分別將2個區(qū)域內(nèi)的菌落研磨成乳狀液，將玻片傾斜搖動混合1 min，觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 選擇性平板分離

取增菌后志賀氏菌增菌液劃線接種選擇性平板，19-A766和19-A835在各平板上生長的菌落形態(tài)見表2。通過志賀氏菌顯色培養(yǎng)基可判斷，白色菌落、周圍培養(yǎng)基紫紅色為志賀氏菌，而黃色菌落可能為沙門氏菌和（或）大腸桿菌，藍綠色菌落可能為產(chǎn)氣腸桿菌和（或）其他菌。

2.2 初步生化試驗

挑取可疑菌落進行初步生化試驗，典型志賀氏菌生化特征是斜面產(chǎn)堿、底層產(chǎn)酸、不產(chǎn)氣、不產(chǎn)硫化氫、半固體管中無動力菌株，初步生化試驗結(jié)果（表3）顯示，19-A835樣品生化試驗結(jié)果與典型志賀氏菌生化特征不符;19-A766樣品從不同選擇性平板上均有符合典型志賀氏菌生化特征的菌落。

2.3 生化試驗 從“2.2”中挑取19-A766樣品中已培養(yǎng)的菌苔進行生化試驗，結(jié)果顯示（表4），19-A766-2、19-A766-3、19-A766-5、19-A766-6、19-A766-7均符合典型志賀氏菌生化特征。

2.4 全自動微生物生化系統(tǒng)鑒定

同時，挑取19-A835和19-A766不同選擇性平板上可疑菌落的純培養(yǎng)物進行全自動微生物生化系統(tǒng)鑒定。其中，19-A835-1鑒定為大腸桿菌，19-A835-2和19-A835-3鑒定為弗羅因德氏枸櫞酸桿菌，因此，樣品19-A835鑒定結(jié)果為未檢出志賀氏菌，符合生化反應(yīng)鑒定結(jié)果;19-A766-1、19-A766-4、19-A766-8鑒定為肺炎克雷伯菌，19-A766-2鑒定為低反應(yīng)生物模型，19-A766-3、19-A766-5、19-A766-6和19-A766-7鑒定為宋內(nèi)氏志賀氏菌，因此樣品19-A766鑒定結(jié)果為檢出志賀氏菌，與生化鑒定結(jié)果相符。

2.5 血清學鑒定

根據(jù)生化試驗結(jié)果，將樣品19-A766中生化鑒定陽性可疑菌落（19-A766-2、19-A766-3、19-A766-5、19-A766-6、19-A766-7）進一步進行血清學鑒定，抗血清中出現(xiàn)凝結(jié)成塊的顆粒，而且生理鹽水中沒有發(fā)生自凝現(xiàn)象，血清學鑒定為陽性。通過生化鑒定結(jié)果和血清學鑒定結(jié)果確定25 mL樣品中，編號19-A835樣品未檢出志賀氏菌，編號19-A766樣品檢出志賀氏菌。

3 結(jié)論與討論

志賀氏菌的傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法在疾病診斷過程中不可或缺，微生物的生存性可在分離培養(yǎng)過程和生化試驗過程中得以體現(xiàn)[4]。采用常規(guī)生化鑒定方法進行志賀氏菌檢驗，可直接對結(jié)果進行直觀性觀察[7]，結(jié)合全自動微生物鑒定儀可降低可疑菌落的假陽性，提高檢測結(jié)果準確性。同時，使用志賀氏菌新生霉素增菌肉湯可排除革蘭氏陽性菌和部分革蘭氏陰性菌的生長，提高目標菌的競爭優(yōu)勢[9]。此次測量審核樣中檢測出大腸桿菌、弗羅因德氏枸櫞酸桿菌、肺炎克雷伯菌作為干擾菌株，這3種菌株均為革蘭氏陰性桿菌。經(jīng)生化試驗、血清學試驗和全自動微生物鑒定儀鑒定結(jié)果顯示，樣品19A-835為志賀氏菌陰性，樣品19A-766為志賀氏菌陽性，測量審核結(jié)果評價為滿意。

使用全自動微生物檢定儀進行檢測時，編號19-A766-2可疑菌落鑒定結(jié)果為低反應(yīng)生物模型，可能是菌落不單一、菌液濃度未達到所需麥氏比濁度，菌落生長不在對數(shù)生長期，光學讀數(shù)頭出現(xiàn)問題導致的[10]?？蛇M一步重新進行試驗，排查問題出現(xiàn)的原因，定期對儀器進行清潔維護，提高全自動微生物鑒定結(jié)果的準確性。

通過此次測量審核結(jié)果，檢測人員可積累判斷假陽性菌落和生化試驗結(jié)果的經(jīng)驗，增加實驗室檢測人員的檢測能力，為進一步檢測工作打下堅實基礎(chǔ)。

參考文獻

[1] 中國合格評定國家認可委員會. 能力驗證規(guī)則：CNAS-RL02：2018[Z].2018.

[2] 區(qū)偉珍.淺談實驗室質(zhì)量控制的方法[J].廣東化工，2015，42（7）：116，83.

[3] 張繼瑜，劉紅，張笑兵，等.志賀氏菌福氏2a毒力大質(zhì)粒DNA全序列的測定與基因分析[J].中國科學（C輯：生命科學），2003，33（1）：40-46.

[4] 崔慶剛，楊志遠，杜永新，等.志賀氏菌的生化特性及檢測方法的研究進展[J].上海畜牧獸醫(yī)通訊，2017（1）：23-25.

[5] 李志明.志賀氏菌傳統(tǒng)檢驗方法研究進展[J]. 食品安全質(zhì)量檢測學報，2019，10（3）：571-575.

[6] 趙懷龍，付留杰，唐功臣. 我國主要的食源性致病菌[J].醫(yī)學動物防制，2012，28（11）：1212-1216.

[7] 中華人民共和國衛(wèi)生部.食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 志賀氏菌檢驗：GB 4789.5—2012[S].北京：中國標準出版社，2012.

[8] 游元丁，趙陽，徐孟懷，等.奶粉中沙門氏菌檢測能力驗證分析[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2019，47（5）：193-195.

[9] 陳雨欣，石建良，蘇粉良，等.能力驗證樣品中志賀氏菌的分離與鑒定[J].農(nóng)產(chǎn)品加工，2015（9）：62-63.

[10] 劉杰，趙滿倉，周海峰. VITEK II 全自動微生物分析系統(tǒng)應(yīng)用問題分析[J].中國醫(yī)療設(shè)備，2013，28（9）：119-121.