王呈文 蔡映舉 范佳偉

摘要 [目的]優(yōu)化毛麝香全草的超聲-酶輔助法提取工藝，并評(píng)價(jià)其抗氧化活性。[方法]采用正交試驗(yàn)優(yōu)選最佳工藝。運(yùn)用 DPPH法、ABTS法、NADH - PMS - NBT反應(yīng)體系法和FRAP法測(cè)定總抗氧化能力4種體外抗氧化活性檢測(cè)方法，并以VC為陽(yáng)性對(duì)照，對(duì)比研究毛麝香4種不同提取物的抗氧化活性。[結(jié)果]最優(yōu)工藝條件為乙醇濃度75%、料液比1∶40（g∶mL）、超聲溫度60 ℃、超聲時(shí)間30 min、纖維素酶用量0.6%，此條件下的提取率為3.48%。毛麝香乙酸乙酯相的抗氧化能力最佳，對(duì)清除3種自由基（DPPH·、ABTS+·、O2·-）的IC50分別為126、156和512 μL，總抗氧化能力測(cè)定值為16.7 mg/g。[結(jié)論]該提取方法簡(jiǎn)便、可行，提取物具有良好的抗氧化能力。

關(guān)鍵詞 毛麝香;超聲-酶輔助;工藝優(yōu)化;抗氧化

Abstract [Objective] The research aimed to optimize the ultrasonicenzymeassisted extraction process of Adenosma glutinosum and evaluate its antioxidant activity. [Method]The best process was preferred using orthogonal test.Four methods of in vitro antioxidant activity detection by DPPH method， ABTS method， NADHPMSNBT reaction system method and FRAP method were used， and VC was used as a positive control. The antioxidant activities of four different extracts of Adenosma glutinosum were compared. [Result]The optimal process conditions were obtained as follow： ethanol concentration of 75%， solidliquid ratio of 1∶40 （g∶mL）， ultrasonic temperature of 60 ℃， ultrasonic time of 30 min and cellulase dosage of 0.6%. The extraction rate of this condition was 3.48%. The ethyl acetate fraction of Adenosma glutinosum had the strongest antioxidant capacity. The IC50 of ethyl acetate fraction for removing three kinds of free radicals （DPPH·， ABTS+·，O2·-） was 126， 156 and 512 μL， respectively， and the total antioxidant capacity was 16.7 mg/g.[Conclusion]The extraction method is simple and feasible， and the extract exhibited strong antioxidant activity.

Key words Adenosma glutinosum; Ultrasonicenzymeassisted; Process optimization; Antioxidant activity

毛麝香[Adenosma glutinosum（L.）Druce]為玄參科毛麝香屬植物，屬直立本草，別名麝香草、涼草、五涼草、酒子草、毛老虎、餅草、香草（廣西）等，分布在我國(guó)南部，是一種藥用性較強(qiáng)的適應(yīng)性野生藥用植物，具有殺菌、消炎、祛風(fēng)止痛、散瘀消腫、解毒止癢等功效。有學(xué)者對(duì)毛麝香進(jìn)行了揮發(fā)油化學(xué)成分的研究及乙醇提取物化學(xué)成分的研究，并分離得到23個(gè)化合物。

目前對(duì)毛麝香的基礎(chǔ)性研究還不夠深入和全面，產(chǎn)業(yè)化發(fā)展程度較低，主要集中為種植及普通的干草藥物銷售上，而一些高附加值的深加工產(chǎn)品目前尚未開發(fā)，沒有充分發(fā)掘其價(jià)值[1-6]。

超聲-酶輔助提取法是一種較新的提取技術(shù)，快速方便可行。超聲提取的主要理論依據(jù)是超聲的空化效應(yīng)、熱效應(yīng)和機(jī)械作用。當(dāng)大能量的超聲波作用于介質(zhì)時(shí)，介質(zhì)被撕裂成許多小空穴，這些小空穴瞬時(shí)閉合，并產(chǎn)生高達(dá)幾千個(gè)大氣壓的瞬間壓力，即空化現(xiàn)象。超聲空化中微小氣泡的爆裂會(huì)產(chǎn)生極大的壓力，使植物細(xì)胞壁及整個(gè)生物體的破裂在瞬間完成，縮短了破碎時(shí)間，同時(shí)超聲波產(chǎn)生的振動(dòng)作用加強(qiáng)了胞內(nèi)物質(zhì)的釋放、擴(kuò)散和溶解，從而顯著提高提取效率。纖維素酶能夠破壞細(xì)胞壁，增加溶劑穿透力，高效快速提取細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)，提高了傳質(zhì)速率，對(duì)提取物的結(jié)構(gòu)和活性不產(chǎn)生影響，從而提高提取率和縮短提取時(shí)間。

目前，對(duì)于毛麝香的超聲-酶輔助法提取工藝及其抗氧化活性的系統(tǒng)研究鮮見相關(guān)報(bào)道。該試驗(yàn)通過設(shè)計(jì)5因素5水平正交試驗(yàn)，對(duì)毛麝香的超聲-酶輔助法提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并進(jìn)行4種不同自由基的系列抗氧化活性的測(cè)試，為進(jìn)一步科學(xué)合理地利用和開發(fā)毛麝香的藥用價(jià)值提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試材

毛麝香，采購(gòu)自廣東汕頭藥材市場(chǎng)，產(chǎn)地為廣東潮汕地區(qū);DPPH·、纖維素酶（400 U/mg），福州飛凈生物科技有限公司;ABTS+·、NBT、PMS、NADH、VC標(biāo)準(zhǔn)品，上海如吉生物科技發(fā)展有限公司;總抗氧化能力檢測(cè)試劑盒（FRAP法），上海碧云天生物技術(shù)有限公司;其余試劑均為國(guó)藥或西隴的分析純。

1.2 儀器

TU-1810紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;DNM-9602自動(dòng)酶標(biāo)分析儀，北京普朗新技術(shù)有限公司;超聲波清洗器，昆侖市超聲儀器有限公司;真空冷凍干燥器，杭州聚同電子有限公司;萬(wàn)分之一電子分析天平，賽多利斯（Sartorius）科學(xué)儀器（北京）有限公司;大龍移液槍及槍頭;其余儀器均為實(shí)驗(yàn)室常用試驗(yàn)分析儀器。

1.3 方法

1.3.1 超聲-酶輔助法提取毛麝香工藝優(yōu)化。

1.3.1.1 樣品溶液的配制。稱取1 g粉粹好的毛麝香，采用超聲協(xié)同纖維素酶輔助提取法對(duì)毛麝香抗氧化活性物質(zhì)進(jìn)行提取，提取后，用高速離心機(jī)分離，取上清液，再使用0.45 μm 微孔濾膜再次過濾，用容量瓶定容至50 mL，待測(cè)[7-12]。

1.3.1.2 DPPH·的清除試驗(yàn)。用無(wú)水乙醇配制0.10 mmol/L的DPPH·溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用并避光[11-15]。

取0.10 mmol/L的DPPH·溶液6 mL，往其中加0.5 mL樣品溶液，混合，避光暗處?kù)o置30 min后，519 nm處測(cè)吸光度A待測(cè)樣。

取6 mL的無(wú)水乙醇，往其中加0.5 mL樣品溶液，混合，519 nm處測(cè)吸光度A待測(cè)樣空白對(duì)照。

取0.10 mmol/L的DPPH·溶液6 mL，再加0.5 mL的無(wú)水乙醇，混合，避光暗處?kù)o置30 min后，519 nm處測(cè)吸光度ADPPH·空白對(duì)照。

按照公式（1）計(jì)算各樣品溶液的DPPH·清除率，試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

DPPH·清除率= 1 -（A待測(cè)樣 - A待測(cè)樣空白對(duì)照） ADPPH·空白對(duì)照×100%（1）

1.3.1.3 正交試驗(yàn)。參考文獻(xiàn)并通過預(yù)試驗(yàn)，得出乙醇濃度（A）、料液比（B）、超聲溫度（C）、超聲時(shí)間（D）、纖維素酶用量（E）是影響毛麝香提取物抗氧化活性的主要因素，故設(shè)計(jì)5因素5水平用正交表L25（56）安排試驗(yàn)，以DPPH·的清除率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，篩選最佳提取工藝。

1.3.2 毛麝香提取物的抗氧化活性研究。

1.3.2.1 毛麝香提取物的制備。將毛麝香全草自然晾干，用粉碎機(jī)粉碎成粉末，稱取毛麝香粉末質(zhì)量1 kg，按照正交試驗(yàn)的最佳提取工藝條件進(jìn)行提取，重復(fù)3次，合并提取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮得到粗提物浸膏，將部分粗提物浸膏真空冷凍干燥至恒重，待用;另一部分粗提物浸膏用超純水重新分散溶解，依次用體積比為1∶1的石油醚、乙酸乙酯各萃取5次，分別減壓濃縮得到石油醚相浸膏、乙酸乙酯相浸膏和剩余水相浸膏，真空冷凍干燥至恒重，各凍干物冷藏保存待用。

1.3.2.2 樣品液的配制。分別準(zhǔn)確稱取0.010 0 g毛麝香乙醇粗提物、石油醚相、乙酸乙酯相和剩余水相凍干物，用無(wú)水乙醇溶解并定容至10 mL，配制成1 mg/mL的樣品液，待測(cè)。

1.3.2.3 DPPH·清除能力測(cè)定。用無(wú)水乙醇配制0.10 mmol/L的DPPH·溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用并避光[11-14]。

取0.10 mmol/L的DPPH·溶液 4 mL，往其中準(zhǔn)確加入x μL不同體積的1 mg/mL 的樣品液（根據(jù)預(yù)試結(jié)果設(shè)用量梯度），再準(zhǔn)確加入（2 000-x）μL的無(wú)水乙醇，混合，避光暗處?kù)o置30 min后，519 nm處測(cè)吸光度A待測(cè)樣。

準(zhǔn)確加入x μL不同體積的1 mg/mL樣品液（根據(jù)預(yù)試結(jié)果設(shè)梯度），再加（6 000-x）μL的無(wú)水乙醇，混合，519 nm處測(cè)吸光度A待測(cè)樣空白對(duì)照。

取0.10 mmol/L的DPPH·溶液 4 mL，再加2 mL的無(wú)水乙醇，混合，避光暗處?kù)o置30 min后，519 nm處測(cè)吸光度ADPPH· 空白對(duì)照。另以x μL 不同體積的1 mg/mL 的VC溶液（根據(jù)預(yù)試結(jié)果設(shè)用量梯度）作為陽(yáng)性對(duì)照。按照公式（1）計(jì)算各溶液的DPPH·清除率，試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.3.2.4 ABTS+·清除能力測(cè)定。用超純水配制2.45 mmol/L 過硫酸鉀和7 mmol/L ABTS+·混合溶液，避光并靜置16 h，配制成ABTS+·儲(chǔ)備液。臨用前用超純水稀釋至吸光度A734 nm=0.70±0.02 的ABTS+·測(cè)試液[11-14]。

取0.10 mmol/L 的ABTS+·測(cè)試液 4 mL，往其中準(zhǔn)確加入x μL 不同體積的1 mg/mL 的樣品液（根據(jù)預(yù)試結(jié)果設(shè)用量梯度），再準(zhǔn)確加入（2 000-x）μL 的無(wú)水乙醇，混合，避光暗處?kù)o置6 min后，734 nm處測(cè)吸光度A待測(cè)樣。

準(zhǔn)確加入 x μL 不同體積的1 mg/mL 的樣品液（根據(jù)預(yù)試結(jié)果設(shè)梯度），再加（2 000-x）μL 的無(wú)水乙醇、4 mL超純水，混合，734 nm處測(cè)吸光度A待測(cè)樣空白對(duì)照。

取0.10 mmol/L的ABTS+·測(cè)試液4 mL，再加2 mL的無(wú)水乙醇，混合，避光暗處?kù)o置6 min 后，734 nm處測(cè)吸光度AABTS·空白對(duì)照。

另以x μL 不同體積的1 mg/mL 的VC溶液（根據(jù)預(yù)試結(jié)果設(shè)用量梯度）作為陽(yáng)性對(duì)照。按照公式（2）計(jì)算各溶液的ABTS+·清除率，試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

ABTS+·清除率=[1 -（A待測(cè)樣 -A待測(cè)樣空白對(duì)照）/AABTS·空白對(duì)照]×100%（2）

1.3.2.5 O2·-清除能力測(cè)定。用超純水分別配制0.3 mmol/L的NBT磷酸緩沖液（0.1 mol/L，pH=7.4）、0.936 mmol/L的NADH磷酸緩沖液（0.1 mol/L，pH=7.4）和0.120 mmol/L的PMS磷酸緩沖液（0.1 mol/L，pH=7.4）[14-15]。

依次分別加入1.5 mL的以上3種磷酸緩沖液，再往其中準(zhǔn)確加入 x μL 不同體積的1 mg/mL 的樣品液（根據(jù)預(yù)試結(jié)果設(shè)用量梯度），再準(zhǔn)確加入（1 500-x）μL 的無(wú)水乙醇，混合，避光暗處?kù)o置5 min后，560 nm處測(cè)吸光度A待測(cè)樣。

準(zhǔn)確加入x μL 不同體積的1 mg/mL 的樣品液（根據(jù)預(yù)試結(jié)果設(shè)梯度），再加（1 500-x）μL 的無(wú)水乙醇，4.5 mL超純水，混合，560 nm處測(cè)吸光度A待測(cè)樣空白對(duì)照。依次分別加入1.5 mL的以上3種磷酸緩沖液，再加1.5 mL的無(wú)水乙醇，混合，避光暗處?kù)o置5 min后，560 nm處測(cè)吸光度AO2·- 空白對(duì)照。

另以x μL 不同體積的1 mg/mL 的VC溶液（根據(jù)預(yù)試結(jié)果設(shè)用量梯度）作為陽(yáng)性對(duì)照。按照公式（3）計(jì)算各溶液的O2·-清除率，試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

O2·-清除率=1 -（A待測(cè)樣 - A待測(cè)樣空白對(duì)照）AO2·-空白對(duì)照×100%（3）

1.3.2.6 FRAP 法測(cè)定總抗氧化能力。用超純水分別配制10 mmol/L TPTZ溶液（40 mmol/L鹽酸溶液配制）、100 mmol/L醋酸緩沖液（pH=3.6）和20 mmol/L氯化鐵溶液，按10∶1∶1的比例進(jìn)行混勻后得RFAP測(cè)試液，現(xiàn)配現(xiàn)用。 取3.9 mL RFAP測(cè)試液，加入0.1 mL 0.5 mg/mL的待測(cè)樣品溶液（濃度根據(jù)預(yù)試結(jié)果設(shè)置），充分混勻后，在37 ℃的恒溫水浴中反應(yīng)10 min，于593 nm下測(cè)定吸光度，以無(wú)水乙醇為空白對(duì)照。結(jié)果表達(dá)為每1 g干重相當(dāng)于Trolox還原力的相當(dāng)量（mg Trolox equivalent antioxidant capacity/g dry weight，mg TEAC/g DW），試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值[14-15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲-酶輔助法提取毛麝香正交試驗(yàn)

由正交試驗(yàn)的測(cè)定結(jié)果（表2）可以分析因素影響的次序，R值越大，影響越大，RA>RB>RC>RE>RD，即影響毛麝香提取物抗氧化活性的因素的主次順序?yàn)橐掖紳舛龋ˋ）>料液比（B）>超聲溫度（C）>纖維素酶用量（E）>超聲時(shí)間（D）;同時(shí)分析k值，可得出最優(yōu)組合為A3B5C5D2E4，即乙醇濃度75%、料液比1∶40（g∶mL）、超聲溫度60 ℃、超聲時(shí)間30 min、纖維素酶用量0.6%，此最佳工藝條件的毛麝香乙醇粗提物的提取率為3.48%。

2.2 毛麝香提取物的抗氧化活性比較

試驗(yàn)結(jié)果表明（表3），毛麝香乙醇粗提物及其不同極性組分均有一定的抗氧化能力，其中乙酸乙酯極性組對(duì)于清除3種自由基（DPPH·、ABTS+·、O2·-）的IC50 值分別為126、156和512 μL，總抗氧化能力測(cè)定值為16.7 mg/g，是4種不同提取物中抗氧化能力最強(qiáng)的組分，但抗氧化能力略低于陽(yáng)性對(duì)照（VC）組。 其余3個(gè)提取物在4種抗氧化評(píng)價(jià)體系中也均表現(xiàn)出相同的變化趨勢(shì)，抗氧化活性強(qiáng)弱從大到小依次為乙酸乙酯相>乙醇粗提物>剩余水相>石油醚相。乙酸乙酯組分中多為中等極性的成分，其含有較豐富的具有良好抗氧化功效的多酚、黃酮類化合物。

2.3 重復(fù)性試驗(yàn)

取5份試樣，按照最佳提取工藝進(jìn)行提取，毛麝香乙醇粗提物的提取率分別為3.38%、3.42%、3.59%、3.48%、3.63%，并用其進(jìn)行DPPH·清除能力測(cè)定，得到的IC50值分別為310、332、308、315、335。

3 結(jié)論

超聲-酶輔助提取法高效簡(jiǎn)便，且提高了毛麝香有效成分的提取率，是一種較為理想的毛麝香抗氧化活性成分的提取方法。通過5因素5水平的正交試驗(yàn)，得出影響毛麝香提取物抗氧化活性的因素的主次順序?yàn)橐掖紳舛龋ˋ）>料液比（B）>超聲溫度（C）>纖維素酶用量（E）>超聲時(shí)間（D），以及最優(yōu)工藝條件為乙醇濃度75%、料液比1∶40（g∶mL）、超聲溫度60 ℃、超聲時(shí)間30 min、纖維素酶用量0.6%，此最佳工藝條件下毛麝香乙醇粗提物的提取率為3.48%，而沒有加入纖維素酶輔助提取的提取率僅為2.61%。

抗氧化活性試驗(yàn)采用了4種抗氧化評(píng)價(jià)方法，較為系統(tǒng)客觀地對(duì)比分析了毛麝香乙醇粗提物及其不同極性組分（乙醇粗提物、石油醚相、乙酸乙酯相、剩余水相）的抗氧化活性，結(jié)果表明4種不同提取物均有一定的抗氧化能力，也均表現(xiàn)出相同的變化趨勢(shì)，抗氧化活性強(qiáng)弱從大到小依次為乙酸乙酯相>乙醇粗提物>剩余水相>石油醚相，其中乙酸乙酯相的抗氧化活性最佳，但抗氧化效果略低于陽(yáng)性對(duì)照（VC）組。

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