劉福君 保明秀 荊笛

摘要 為探究雜交鲀（紅鰭東方鲀×菊黃東方鲀）與紅鰭東方鲀差異的分子調(diào)節(jié)機制，利用Illumina高通量測序技術(shù)對紅鰭東方鲀及雜交鲀的腦、腎臟樣本組織進行轉(zhuǎn)錄組測序，篩選差異表達基因。結(jié)果表明：通過RNA-seq技術(shù)共篩選到2 207個DEGs （腦）和1 823個DEGs （腎臟）。其中在腦組織樣本中有1 068個DEGs表達上調(diào)，1 139個DEGs表達下調(diào)，腎臟組織樣本中有851個DEGs表達上調(diào)，972個DEGs表達下調(diào);通過GO功能分類與KEGG富集分析，將腦組織的差異基因區(qū)分為60個功能類別及137個代謝途徑，包括G蛋白偶聯(lián)受體信號通路、跨膜轉(zhuǎn)運、分子功能調(diào)節(jié)劑、鈣離子結(jié)合等;腎臟組織的差異基因被區(qū)分為31個功能分類及142個代謝途徑，包括氧化還原酶活性、肽酶活性、蛋白水解、細胞外區(qū)域等。該研究探討了雜交鲀與紅鰭東方鲀生長發(fā)育差異過程的相關(guān)分子調(diào)控機制，可為后續(xù)相關(guān)研究提供初步理論參考與依據(jù)。

關(guān)鍵詞 紅鰭東方鲀;轉(zhuǎn)錄組;高通量測序;功能注釋

Abstract The study is to explore the molecular regulatory mechanism of the differences between the hybrid puffers fish（Takifugu rubripes×Takifugu flavidus） and Takifugu rubripes.In this study， Illumina highthroughput sequencing technology was used to sequence transcriptomes of the brain and kidney samples of Takifugu rubripes and hybrid puffers， screen differentially expressed genes. The results showed that 2 207 DEGs （brain） and 1 823 DEGs （kidney） were screened by RNAseq technology.Among them，1 068 DEGs were upregulated and 1 139 DEGs were downregulated in brain samples.And 851 DEGs were upregulated and 972 DEGs were downregulated in kidney samples.Through GO functional classification and KEGG enrichment analysis， the differential genes were divided into 60 functional categories and 137 metabolic pathways in the brain samples，which included Gprotein coupled receptor signaling pathway， transmembrane transport， molecular function regulator and calcium ion binding，etc..Differential genes in kidney tissue were divided into 31 functional categories and 142 metabolic pathways， which included oxidoreductase activity， peptidase activity， proteolysis and extracellular region，etc..This study discussed the mechanism of molecular regulation in the process of growth and development differences between hybrid puffers fish and Takifugu rubripes，which can provide a preliminary theoretical reference and basis for the followup research.

Key words Takifugu rubripes;Transcriptome;Highthroughput sequencing;Function notes

將帶有不同遺傳性狀的兩個親本進行雜交，產(chǎn)生的子代所具備的性狀均優(yōu)于雙親的生物學(xué)現(xiàn)象，稱為雜交優(yōu)勢（heterosis，hybrid vigor），比如雜交后代的抗逆性、早熟高產(chǎn)、品質(zhì)優(yōu)越等生物學(xué)現(xiàn)象。水產(chǎn)方面，我國成功培育了許多雜交鯉，如興國紅鯉與散鱗鏡鯉雜交產(chǎn)生的豐鯉、荷包紅鯉與沅江鯉雜交產(chǎn)生的荷沅鯉和建鯉、荷包紅鯉與湘江野鯉雜交產(chǎn)生的岳鯉等，研究發(fā)現(xiàn)雜交鯉產(chǎn)量至少增加30%，多者可達2.5倍以上[1-3]，另外將鯽魚與其遠緣雜交的后代具有肉質(zhì)鮮美、生長速度快、廣食性等優(yōu)點[4-5]。

東方鲀屬屬于硬骨魚綱（Osteichthyes），鲀形目（Tetraodontiformes），鲀亞目（Tetraodontidei），鲀科（Tetraodontidae），在我國主要分布于東海、黃海及渤海[6]，周邊地區(qū)主要分布在朝鮮半島和北太平洋西部的日本，代表物種是紅鰭東方鲀和菊黃東方鲀，其肉質(zhì)營養(yǎng)豐富，蛋白含量高，是一種高經(jīng)濟價值的魚類[7]。但是菊黃東方鲀的生長速度較慢，而紅鰭東方鲀是東方鲀中生長速率最快、體型最大的種類[8-9]。已有相關(guān)研究顯示紅鰭東方鲀和菊黃東方鲀的雜交后代，具有養(yǎng)殖存活率高、生長速度快等優(yōu)良性狀，可利用其雜交優(yōu)勢來進行增產(chǎn)增效。

轉(zhuǎn)錄組（transcriptome）有廣義與狹義上的解釋。廣義上轉(zhuǎn)錄組是指在特定條件下的細胞或組織的所有RNA總和，包括非編碼RNA （noncoding RNA）和信使RNA （mRNA），狹義上轉(zhuǎn)錄組是指細胞內(nèi)全部轉(zhuǎn)錄出來的信使RNA，轉(zhuǎn)錄組具有空間與時間的限制，通過提供相應(yīng)基因的時空表達情況來進一步確定其生理調(diào)節(jié)機制，具有高通量、高靈敏度、高準確性及成本相對較低等優(yōu)勢，目前已廣泛應(yīng)用于各種生物轉(zhuǎn)錄組的研究[10-12]。

該研究利用Illumina高通量測序技術(shù)對紅鰭東方鲀及雜交鲀進行轉(zhuǎn)錄組測序及比較分析，測序數(shù)據(jù)通過篩選、拼接和組裝，然后再進行功能分類、功能注釋及代謝途徑分析，以期為后期深入研究雜交河鲀生長發(fā)育的分子調(diào)控機制提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料 試驗用魚為大連天正實業(yè)有限公司唐山咀東養(yǎng)殖場的紅鰭東方鲀和雜交鲀（紅鰭東方鲀×菊黃東方鲀），同一批孵化及同條件飼養(yǎng)情況下挑選活力較強、體格健壯、身體無損傷的成魚各10條。采樣所需的剪、咬骨鉗、鑷子、刀等器械均事先通過高壓滅菌鍋進行121 ℃，2 h滅菌，采樣前使用75%乙醇擦拭且經(jīng)火焰消毒。將試驗魚現(xiàn)場解剖，分別取全腦及腎臟組織儲存于10倍體積的RNA later中，以便后續(xù)總RNA提取。

1.2 總RNA提取 cDNA文庫構(gòu)建和測序

利用RNA提取試劑盒提取紅鰭東方鲀和雜交鲀（紅鰭東方鲀×菊黃東方鲀）的總RNA。為了保證試驗數(shù)據(jù)的高質(zhì)量，上述提取的總RNA需要進行瓊脂糖凝膠電泳、紫外分光光度計和Aglient 2100方法檢測，主要包括樣品濃度、純度及完整性，A260/A280、A260/A230、28S/18S、RIN （RNA integrity number）。RNA質(zhì)量要求有如下指標：RIN=7.0，A260/A280為1.8～2.0，28S/18S為1.5。通過完整性及純度檢測后，使用Oligo（dT）磁珠純化和進行mRNA的富集，隨后進行mRNA的分離及片段化，合成一鏈和二鏈cDNA。之后再進行3′末端加A，連接測序接頭末端修復(fù)，而后用AMPure XP beads篩選250～300 bp的cDNA，最后富集cDNA文庫。將上述cDNA文庫進行Illumina測序，首先過濾原始數(shù)據(jù)中低質(zhì)量、末端質(zhì)量低、含測序引物的reads，得到clean reads，然后再進行de novo拼接，最后通過CAP3軟件拼接來獲得最終Unigene序列集合[13]。使用DEGseq軟件找尋篩選差異表達基因（differentially expressed genes，DEGs）時以P<0.05作為標準[14]。

1.3 差異表達基因GO與KEGG富集分析

通過FPKM （fragments per kilobase of transcript per million fragments mapped）[14]方法對Unigenes進行DEGs表達量計算。通過軟件cuffdiff來分析轉(zhuǎn)錄本與基因水平上的差異表達，差異表達的基因和轉(zhuǎn)錄本需要滿足以下標準：計算表達倍數(shù)變化（fold change），需要|log2 FoldChange|>1;2個樣本中mapping reads數(shù)之和≥10;對P進行FDR校正得到Q，同時需要P≤0.05及Q≤1。最后將所得的差異表達基因單獨進行聚類分析、Pathway分析和GO功能分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)質(zhì)控分析

分別取紅鰭東方鲀腦組織（H_B1）、腎臟組織（H_L1），雜交鲀（紅鰭東方鲀×菊黃東方鲀）的腦組織（Z_B2）和腎臟組織（Z_L2），利用RNA-seq技術(shù)對樣品文庫進行測序，分別得到Raw reads 59 463 756、48 936 330、49 340 508和49 165 672條;去除N含量超過10% （containing N）、帶有接頭（adapter related）和低質(zhì)量（low quality）的reads以后得到Clean reads分別為58 214 792、48 236 284、48 530 284和47 363 626;Phred值大于20、30的堿基比例（Q20， Q30）分別為97.62%、98.20%、97.74%、98.12%（Q20）以及93.56%、94.75%、93.78、94.60% （Q30）;總堿基數(shù)中堿基C和G數(shù)量總和占比分別為48.92%、53.79%、48.98%和52.56%（表1）。

2.2 差異基因的篩選

根據(jù)FPKM法[15-16]對樣品間差異進行分析，分別用紅色、藍色和綠色表示顯著上調(diào)基因、顯著下調(diào)基因和無顯著性差異基因，結(jié)果顯示共得到差異表達基因（DEGs）共2 207個（腦組織，圖1）和1 823個（腎臟組織，圖2）。其中雜交鲀的腦組織樣本相對于紅鰭東方鲀的腦組織樣本表達上調(diào)的DEGs有1 068個，表達下調(diào)的有1 139個。各差異表達基因的水平不同（log2FoldChange高度不同），差異水平變化主要存在于>2～≤7 （上調(diào)基因占48.36%， 下調(diào)基因占51.64%），其次為>0～≤2 （上調(diào)基因占45.23%，下調(diào)基因占54.77%），最后是>7～≤15 （上調(diào)基因占71.33%，下調(diào)基因占28.67%）;而雜交鲀的腎臟組織樣本相對于紅鰭東方鲀的腎臟組織樣本表達上調(diào)的有851個，表達下調(diào)的有972個，同樣主要集中在>2～≤7 （上調(diào)基因占39.66%， 下調(diào)基因占60.34%），其次為0～≤2 （上調(diào)基因占55.14%， 下調(diào)基因占44.86%），最后是>7～≤15 （上調(diào)基因占49.36%，下調(diào)基因占50.64%） （表2）。

2.3 差異基因GO分析

差異表達基因經(jīng)過GO富集分析可分為三大類，分別是描述基因產(chǎn)物及個體基因的分子功能（molecular function， MF），描述亞細胞結(jié)構(gòu)、位置及大分子復(fù)合體的細胞組成（cellular component， CC）與描述參與基因編碼的生物學(xué)過程（biological process， BP）。對篩選到的差異表達基因進行GO富集分析，結(jié)果顯示在紅鰭東方鲀和雜交鲀的腦組織樣本中，差異表達基因可主要歸納于35個生物學(xué)過程、15個細胞組成以及10個分子功能（圖3）。

在生物學(xué)過程中以G蛋白偶聯(lián)受體信號通路（G-protein coupled receptor signaling pathway） （70個）和跨膜轉(zhuǎn)運（transmembranetransport） （66個）存在較多差異表達基因;在分子功能方面，差異表達基因集中于分子功能調(diào)節(jié)劑（molecular function regulator） （69個）以及鈣離子結(jié)合（calcium ion binding）（66個）。

而在腎臟組織樣本中，差異表達基因主要歸納于26個分子功能、4個生物學(xué)功能和1個細胞組成（圖4）。差異表達基因在分子功能中以氧化還原酶活性（oxidoreductase activity） （70個）和肽酶活性（peptidase activity） （66個）居多;生物學(xué)過程上集中在氧化還原過程（oxidationreduction process） （66個）及蛋白水解（proteolysis） （65個）;在細胞組成上則存在于細胞外區(qū)域（extracellular region） （51個）。結(jié)果表明紅鰭東方鲀和菊黃東方鲀的雜交后代在生長發(fā)育上主要是通過以上富集途徑的差異表達基因來調(diào)控的。

2.4 KEGG代謝途徑分析

選取padj值最小的前20條通路（pathway），以顏色來區(qū)分不同padj范圍，點的大小來表示注釋到KEGG通路編號上的差異基因數(shù)，從而繪制散點圖。如圖5所示，腦組織樣品經(jīng)過KEGG富集分析共建立了137條pathway，在神經(jīng)活性配體-受體相互作用（neuroactive ligandreceptor interaction）中差異表達基因最多，共有81個;其次為鈣信號通路（calcium signaling pathway），達42個;細胞黏附分子（cell adhesion molecules，CAMs）達33個。另一方面，腎臟組織樣品經(jīng)KEGG富集分析共建立了142條pathway，其中神經(jīng)活性配體-受體相互作用達40個;NOD樣受體信號通路（NODlike receptor signaling pathway）達30個（圖6）。這些通路的padj值較小，說明這些通路的富集程度較高。結(jié)果表明紅鰭東方鲀和雜交鲀的腦組織和腎臟組織樣品中以神經(jīng)活性配體-受體相互作用中相關(guān)差異基因的表達最為活躍。

3 討論與結(jié)論

通常情況下雜交后代會比親本的抗逆性強、早熟高產(chǎn)、品質(zhì)優(yōu)越等。前期已有相關(guān)研究顯示紅鰭東方鲀和菊黃東方鲀的雜交后代在生長速率方面顯著高于菊黃東方鲀，但未超過紅鰭東方鲀，而在肉質(zhì)方面，雜交東方鲀和菊黃東方鲀保持了基本一致的極佳口感，且對低水溫、重金屬離子、鹽度的波動均有良好的抗逆性[17-19]。

該研究應(yīng)用Illumina高通量測序技術(shù)對紅鰭東方鲀及雜交鲀（紅鰭東方鲀與菊黃東方鲀雜交后代F1）腦和腎臟的轉(zhuǎn)錄組測序，分別篩選到2 207個和1 823個差異表達基因進行GO富集分析和KEGG功能富集分析，結(jié)果顯示雜交鲀與紅鰭東方鲀的差異表達基因主要富集在神經(jīng)活性配體-受體相互作用過程、NOD樣受體信號通路和鈣信號通路過程等，且在神經(jīng)活性配體-受體相互作用過程中存在生長激素（growth hormone， GH）和催乳素（prolactin，PRL）的調(diào)控。在魚類的生長內(nèi)分泌調(diào)控方面，催乳素和生長激素都是較為重要的影響因素[20]，其對魚類的生長發(fā)育起到了重要作用，如催乳素可以維持體內(nèi)外電解質(zhì)和水的平衡、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌與新陳代謝、腦功能和行為協(xié)調(diào)、免疫調(diào)節(jié)和保護、繁殖以及促進生長和發(fā)育[21];而生長激素可以促進消化系統(tǒng)的氨基酸吸收及增加組織細胞的RNA合成進而促使魚體蛋白質(zhì)合成，提高食物轉(zhuǎn)化率，還有調(diào)節(jié)魚類生殖功能、促進體細胞分裂、增強魚體免疫力和刺激骨骼肌肉組織發(fā)育等效果[22-23]。因此初步推測神經(jīng)活性配體-受體相互作用過程、NOD樣受體信號通路和鈣信號通路過程可能是雜交鲀雜交優(yōu)勢的主要由來，但還需要進一步研究證明。

該研究通過對紅鰭東方鲀及雜交鲀的轉(zhuǎn)錄組比較分析，揭示了神經(jīng)活性配體-受體相互作用途徑可能參與調(diào)控出了雜交鲀的雜交優(yōu)勢，為后期繼續(xù)進行雜交鲀和紅鰭東方鲀生長發(fā)育差異過程的相關(guān)分子調(diào)控機制的研究提供了初步理論依據(jù)與參考，有利于進一步提高雜交河鲀的經(jīng)濟價值。

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