鮑玉杰 尚玉曼 王恒

摘要 從患皮膚潰瘍病的半滑舌鰨肝臟中分離到一株優(yōu)勢菌株CSLG2，根據(jù)細(xì)菌形態(tài)學(xué)觀察、生理生化鑒定、16S rDNA序列鑒定及系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)該菌株與假交替單胞菌屬（Pseudoalteromonas）同源性最高。對該菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該菌對米諾環(huán)素、紅霉素、頭孢他啶、頭孢曲松、氯霉素、諾氟沙星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星等藥物高度敏感，而對紅霉素、四環(huán)素、頭孢唑啉、頭孢拉定、青霉素和呋喃妥因具有一定的耐藥性。

關(guān)鍵詞 半滑舌鰨;假交替單胞菌;16S rDNA;藥敏特性

Abstract A dominant strain CSLG2 was isolated from the liver of Cynoglossus semilaevis Günther with skin ulcer disease.According to the results of bacterial morphology observation，physiological and biochemical identification，16S rDNA sequence identification and phylogenetic tree analysis，the results showed that this strain had the highest homology with Pseudoalteromonas.The drug sensitivity test results of this strain showed that the bacteria was highly sensitive to minocycline，erythromycin，ceftazidime，ceftriaxone，chloramphenicol，norfloxacin，ofloxacin，and ciprofloxacin.However，it had certain resistance to erythromycin，tetracycline，cefazolin，ceftriaxone，penicillin and nitrofurantoin.

Key words Cynoglossus semilaevis Günther;Pseudoalteromonas;16S rDNA;Drug sensitivity

半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis Günther） 是一種溫水性近海大型底層魚類，隸屬鰈形目（Pleuronectiforme）舌鰨科（Cnoglossidae）舌鰨屬（Cynoglosus），由于其活動范圍小、營養(yǎng)等級低、個(gè)體大、生長快，目前已成為我國沿海地區(qū)海水養(yǎng)殖魚類的優(yōu)良品種之一[1-2]。但是，隨著產(chǎn)業(yè)規(guī)模的不斷擴(kuò)大，近年來養(yǎng)殖半滑舌鰨陸續(xù)發(fā)生各種疾病，臨床常見體表潰瘍病、爛尾病、腹水癥等[3-5]。目前鰨類疾病主要有細(xì)菌性疾病、寄生蟲性疾病、病毒性疾病3種類型，其中報(bào)道最多的是細(xì)菌性疾病，其主要病原有哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）、溶藻弧菌（V.alginolyticus）、副溶血弧菌（V.parahaemolyticus）、河口弧菌（V.aestuarianu）、鰻利斯頓氏菌（Listonella anguillarum）、海水屈撓桿菌（Tenacibaculum maritimum）、鰨屈撓桿菌（T.soleae）、遲緩愛德華氏菌（Edwardsiella tarda）等[6]。為進(jìn)一步研究養(yǎng)殖半滑舌鰨潰瘍病的病原及其發(fā)病機(jī)制，筆者對患病半滑舌鰨進(jìn)行了病原菌篩取，主要從患病半滑舌鰨的體表、腎臟、脾臟、鰓、腸等部位分離出病原菌，經(jīng)過形態(tài)觀察、生理生化鑒定、16S rDNA序列分析及系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析鑒定出一株假交替單胞菌，編號為CSLG2，并對其進(jìn)行了藥敏試驗(yàn)，旨在進(jìn)一步探究其致病機(jī)制并為半滑舌鰨潰瘍病的防控提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株。菌株CSLG2分離自天津市某養(yǎng)殖場中養(yǎng)殖的患潰瘍病的半滑舌鰨肝臟。

1.1.2 試劑。2216E瓊脂、TSB培養(yǎng)基均購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司;2×Taq PCR Master Mix酶、DNA Marker 購自博邁德生物有限公司;生化鑒定管、生物藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司。

1.1.3 儀器。超凈工作臺（SW-CJ-1FD，江蘇通凈凈化設(shè)備有限公司）;高壓滅菌鍋（SX-500，江陰濱江醫(yī)療有限公司）;離心機(jī)（Centrifuge 5415R Eppendorf）;PCR儀（BIO-BAO）;恒溫培養(yǎng)箱（SPX-105B-D，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）;pH計(jì)（METTER TOLEDO，北京六一儀器廠）;數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-3A型，金壇市金南儀器制造有限公司）;電泳儀（DYY-6C型，北京六一儀器廠）。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離與純化。在無菌條件下，用接種環(huán)蘸取患病半滑舌鰨的皮膚潰爛處、肝臟、脾臟、腎臟、腸道等，并在2216E瓊脂、TSB等固體培養(yǎng)基上劃線，置于28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h。挑取形態(tài)特征一致的優(yōu)勢單菌落，再次接種到2216E固體培養(yǎng)基上進(jìn)行分離純化，連續(xù)分離、純化3次后，挑取優(yōu)勢單菌落置于滅菌的2216E液體培養(yǎng)基中，28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，將獲得的純化菌株加入20%的甘油保種，于-80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察。首先在載玻片中央滴1滴水，用接種環(huán)挑取少量單菌落在載玻片上涂片固定，然后進(jìn)行革蘭氏染色，在油鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)。

1.2.3 生理生化鑒定。將純化得到的CSLG2菌株在2216E固體培養(yǎng)基上劃線，28 ℃培養(yǎng)24 h后，使用無菌牙簽挑取單菌落接種于細(xì)菌生化鑒定管中，并滴加1滴液體石蠟油，置于35 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察其顏色變化。參照《伯杰氏鑒定細(xì)菌學(xué)手冊》和《伯杰氏分類細(xì)菌學(xué)手冊》[7]，確定其生理生化特性。

1.2.4 16S rDNA檢測鑒定與系統(tǒng)發(fā)育分析。

1.2.4.1 16S rDNA的PCR擴(kuò)增。從患病半滑舌鰨肝臟處分離到優(yōu)勢菌株CSLG2，將純化得到的CSLG2菌株接種在2216E液體培養(yǎng)基中，28 ℃、220 r/min恒溫?fù)u床中培養(yǎng)16 h后，取200 μL菌液在100 ℃沸水中煮10 min，然后1 200 r/min 離心10 min，上清即為DNA。以此DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系如下：模板DNA 1 μL、上下游引物各0.5 μL、2×Taq PCR MasterMix 6.25 μL、無菌水4.25 μL。PCR反應(yīng)條件如下：94 ℃預(yù)變性3 min、94 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸45 s、72 ℃終延伸5 min。其中，PCR所用引物為細(xì)菌16S rDNA通用引物，正向引物為27 F（AGAGTTTGATCCTGGCTCAG），反向引物為1492 R（GGTTACCTTGTTACGACTT），引物由六合華大基因合成。

1.2.4.2 PCR產(chǎn)物的檢測及序列分析。取2 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，其余送交上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果通過NCBI網(wǎng)站的BLAST檢索系統(tǒng)進(jìn)行同源系列比對分析，從中選取高度相似的序列，使用MEGA 6（molecular evolutionary genetic analysis，MEGA）軟件構(gòu)建16S rDNA的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1.2.5 藥物敏感性測定。采用K-B紙片瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)[8]，取純化菌株CSLG2接種于2216E液體培養(yǎng)基中，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h后，進(jìn)行梯度稀釋，采用平板計(jì)數(shù)方法配制1.0×108 CFU/mL的菌液，吸取100 μL涂布在2216 E固體培養(yǎng)基平板上。然后，用無菌鑷子將抗生素紙片輕輕貼在培養(yǎng)基表面，28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后，測定抑菌圈直徑，結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)分為敏感（S）、中敏（I）、耐藥（R）。

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床癥狀

患病的半滑舌鰨前期體表掉鱗，隨著病情的加重，體表肌肉潰爛，潰瘍面積不斷增大;腹部腫脹，嚴(yán)重的有脫肛現(xiàn)象，經(jīng)解剖后腹腔中有大量腹水，嚴(yán)重時(shí)可致死（圖1）。

2.2 細(xì)菌形態(tài)學(xué)特征

菌株CSLG2在2216E瓊脂培養(yǎng)基平板上劃線得到單菌落，菌落呈圓形，表面光滑濕潤、有光澤，中央凸起，呈淡黃色，不透明，邊緣整齊（圖2）。革蘭氏染色結(jié)果顯示，菌株CSLG2為短桿狀，呈紅色，說明該菌株為革蘭氏陰性菌（圖3）。

2.3 生理生化特征

從細(xì)菌生化鑒定管的結(jié)果來看，CSLG2菌株對麥芽糖、N-乙酰葡糖胺的反應(yīng)均呈陽性，并能利用葡萄糖，不能利用蔗糖，與側(cè)金盞花醇反應(yīng)呈陰性，其余反應(yīng)也均呈陰性（表1）。將生化管的鑒定結(jié)果結(jié)合《伯杰氏鑒定細(xì)菌學(xué)手冊》，其鑒定結(jié)果與假交替單胞菌最為相似。

2.4 16S rDNA序列分析及系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析

以CSLG2菌株全DNA為模板，以通用引物27F 和 1492R 擴(kuò)增得到CSLG2菌株16S rDNA，通過瓊脂糖凝膠電泳得到一條1 500 bp 左右的條帶，條帶清晰且單一（圖4）。其余PCR產(chǎn)物經(jīng)測序得到CSLG2菌株16S rDNA的序列大小為1 646 bp。將測序得到的拼接序列在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST比對，發(fā)現(xiàn)菌株CSLG2與假交替單胞菌（Pseudoalteromonas sp.IG23 ，序列號KU213138.1）同源性高達(dá)99%，由此可初步判定CSLG2菌株為假交替單胞菌屬。將CSLG2 16S rDNA序列與其同源性較高的序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析，結(jié)果顯示其與Pseudoalteromonas sp.IMCC17052聚為一支，與Pseudoalteromonas sp.IG23同源性也較高（圖5），進(jìn)一步說明菌株CSLG2菌株為假交替單胞菌。

2.5 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，CSLG2菌株對紅霉素、四環(huán)素、頭孢唑啉、頭孢拉定、青霉素、呋喃妥因均有耐藥性，對鏈霉素、磺胺異噁唑表現(xiàn)為中度敏感，而其他26種藥物均具有一定的抑菌效果，其中米諾環(huán)素、紅霉素、頭孢他啶、頭孢曲松、氯霉素、諾氟沙星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星等具有較強(qiáng)的抑菌能力（表2）。

3 討論與結(jié)論

假交替單胞菌屬是 Gauthier 等[9]根據(jù)細(xì)菌16S rDNA 序列對交替單胞菌屬（Alteromonas）、希瓦氏菌屬（Shewanella）、弧菌屬（Vibrio）以及假單胞菌屬（Pseudomonas）等若干菌株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)的區(qū)別于假單胞菌屬（ Pseudomonas） 和交替單胞菌屬（Alteromonas）的一個(gè)新屬。該菌廣泛分布于海洋環(huán)境中，是一類條件致病菌，能產(chǎn)生胞外毒素、胞外多糖、胞外酶以及病毒活性物質(zhì)等與致病相關(guān)的多種物質(zhì)[10]。研究表明，假交替單胞菌可感染海水養(yǎng)殖藻類和養(yǎng)殖動物等，可引起藻類（如綠斑、黃斑[11-12]等）和養(yǎng)殖動物體表潰爛[13]等疾病。假交替單胞菌是引起海帶（Laminaria）孢子體紅點(diǎn)病[14]和孔爛癥[15]的病原菌，假交替單胞菌還可引起刺參（Apostichopus japonicus）腐皮病[16]、潰瘍病[17]等。Pujalte 等[18]從患病的海鱸體內(nèi)分離到1株假交替單胞菌，并發(fā)現(xiàn)其在養(yǎng)殖環(huán)境惡化時(shí)引起金頭鯛和海鱸患病。喬遷等[19]從皮膚潰爛的七帶石斑魚（Epinephelus septemfasciatus）中分離出一株假交替單胞菌，并發(fā)現(xiàn)其可引起劍尾魚鱗片脫落、體表潰爛至死亡。白雪松等[10]從群體死亡日本對蝦（Penaeus japonicus）蚤狀幼體中分離到 1 株致病菌，經(jīng)鑒定為假交替單胞菌，并通過回復(fù)感染證實(shí)其對蚤狀幼體和仔蝦具有致死性。

該研究從患病的半滑舌鰨肝臟處分離到一株優(yōu)勢菌株CSLG2，根據(jù)菌落形態(tài)、細(xì)菌革蘭氏染色特征、生理生化鑒定、16S rDNA序列鑒定和系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析結(jié)果鑒定該菌株為假交替單胞菌。根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果，初步鑒定出CSLG2菌株對紅霉素、四環(huán)素、頭孢唑啉、頭孢拉定、青霉素、呋喃妥因有耐藥性，而米諾環(huán)素、紅霉素、頭孢他啶、頭孢曲松、氯霉素、諾氟沙星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星等具有較強(qiáng)的抑菌能力，該研究結(jié)果有助于探討魚類疾病病原，并為防治該菌引起的半滑舌鰨及其他水生動物疾病提供參考。

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