任星潮 李榮 張寧

摘要 [目的]探討新型圖像流式細(xì)胞儀在貝類血細(xì)胞分類中的應(yīng)用。[方法]建立了一種基于血細(xì)胞側(cè)向散射強(qiáng)度和面積測(cè)量的自動(dòng)化方法，并與顯微觀察對(duì)比其在文蛤和菲律賓蛤仔血細(xì)胞分類中的效果。[結(jié)果]參考顯微鏡下可辨識(shí)的胞內(nèi)顆粒結(jié)構(gòu)，2種貝類的血細(xì)胞均可分為無(wú)顆粒、小顆粒及大顆粒3類，但基于人工辨識(shí)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果缺乏量化標(biāo)準(zhǔn)，因此波動(dòng)較大。圖像流式細(xì)胞儀通過(guò)定量分析可以獲得更精細(xì)、準(zhǔn)確的測(cè)量結(jié)果。根據(jù)側(cè)向散射強(qiáng)度和面積差異，將文蛤和菲律賓蛤仔的血細(xì)胞分成無(wú)顆粒、小顆粒、中顆粒及大顆粒4類，占比分別為（6.59±1.11）%和（30.03±1.87）%、（34.85±2.95）%和（58.50±5.73）%、（21.95±0.75）%和（6.03±1.44）%、（36.75±4.75）% 和（5.36±2.38）%。2種貝類血細(xì)胞都呈現(xiàn)出由無(wú)顆粒細(xì)胞到大顆粒細(xì)胞逐漸增大的趨勢(shì)。[結(jié)論] 2種方法的分析結(jié)果既有聯(lián)系又不完全一致。相較于顯微觀察，圖像流式細(xì)胞儀利用精確的量化標(biāo)準(zhǔn)可辨識(shí)出更多的細(xì)胞類群，提示綜合利用不同的特征差異還可以獲得更精細(xì)的分類結(jié)果。此外，自動(dòng)化的定量測(cè)量準(zhǔn)確性好、通量高，是今后貝類血細(xì)胞分析的重要方法。

關(guān)鍵詞 文蛤;菲律賓蛤仔;血細(xì)胞;分類;流式細(xì)胞儀

Abstract [Objective] To discuss the application of a new kind of imaging flow cytometer in the classificatioin of shellfish hemocyte. [Method] An automated method based on the measurement of blood cell lateral scattering intensity and area was established，and its effect on hemocyte classification of Meretrix meretrix and Ruditapes philippinarum was compared with microscopic observation. [Result] Both of the hemocytes from the above shellfishes could be divided into 3 hemocyte populations of nongranular， smallgranular and largegranular hemocyte by microscopic observation according to the differences of distinguishable intracellular particles， but the proportions fluctuated due to lacking of quantitative criteria. More accurate results could be acquired by using a quantitative measurement of imaging flow cytometer. According to the difference of the side scattering intensity and area， the hemocytes of M. meretrix and R. philippinarum were divided into four types： nongranular， smallgranular， intermediategranular and largegranular hemocytes， and their populations in M. meretrix and R. philippinarum were （6.59±1.11）% and （30.03±1.87）%， （34.85±2.95）% and （58.50±5.73）%， （21.95±0.75）% and （6.03±1.44）%， （36.75±4.75）% and （5.36±2.38）% respectively. The cell size increased gradually from R1 to R4 for each shellfish.[Conclusion] Although there are differences between the consistencies between two methods still could be found. Compared with microscopic observation， the image flow cytometer can identify more cell groups by using precise quantification standards， suggesting that more refined classification results could be? obtained by using comprehensive use of different feature differences. In addition， automated quantitative measurement had good accuracy and high throughput，it is an important analysis method for? blood cells of shellfish in the future.

Key words Meretrix meretrix;Ruditapes philippinarum;Hemocyte;Classification;Flow cytometer

文蛤（Meretrix meretrix）和菲律賓蛤仔（Ruditapes philippinarum）同屬軟體動(dòng)物門雙殼綱簾蛤目簾蛤科，是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)貝種[1]。隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，養(yǎng)殖環(huán)境跟不上發(fā)展的矛盾越來(lái)越突出，病害也日趨嚴(yán)重，給貝類養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。文蛤、菲律賓蛤仔以及其他貝類都具有開(kāi)放式循環(huán)系統(tǒng)，免疫防御基于血細(xì)胞為基礎(chǔ)的細(xì)胞和體液系統(tǒng)。一方面，血細(xì)胞通過(guò)吞噬各種有機(jī)和無(wú)機(jī)等顆粒和異物，清除異物、病原以及自身?yè)p傷或死亡細(xì)胞;另一方面，血細(xì)胞還可以持續(xù)或應(yīng)激產(chǎn)生各種必要的體液因子來(lái)調(diào)節(jié)免疫水平，調(diào)動(dòng)防御系統(tǒng)參與宿主的免疫應(yīng)答過(guò)程[2-4]，因此血細(xì)胞是免疫系統(tǒng)研究的核心，既參與了細(xì)胞免疫又是體液免疫的物質(zhì)基礎(chǔ)。分類是功能研究的基礎(chǔ)，長(zhǎng)期以來(lái)關(guān)于貝類血細(xì)胞的分類一直存在不同的看法，長(zhǎng)期缺乏統(tǒng)一的命名及量化標(biāo)準(zhǔn)[5-6]。有人將其分為無(wú)顆粒細(xì)胞、小顆粒細(xì)胞及大顆粒細(xì)胞3類，也有人認(rèn)為還應(yīng)劃分出漿細(xì)胞作為第4類血細(xì)胞。人工辨識(shí)和常規(guī)流式細(xì)胞儀通常可以將貝類血細(xì)胞劃分為2～3種。為了更準(zhǔn)確地開(kāi)展貝類血細(xì)胞功能解析，筆者嘗試采用新型圖像流式細(xì)胞儀開(kāi)展貝類血細(xì)胞分析，以期清晰地區(qū)分出各個(gè)血細(xì)胞類群。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

1.1.1

試驗(yàn)材料。試驗(yàn)用文蛤和菲律賓蛤仔購(gòu)自天津市王頂?shù)趟a(chǎn)批發(fā)市場(chǎng)。文蛤殼長(zhǎng)（48.6±5.4）mm，菲律賓蛤仔殼長(zhǎng)（35.2±4.6）mm，置于實(shí)驗(yàn)室循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)暫養(yǎng)，鹽度為（20±1）‰，水溫為（20±1）℃。暫養(yǎng)5 d后，選擇活力旺盛、體表無(wú)明顯傷殘的個(gè)體用于試驗(yàn)。

1.1.2 試劑。

多聚甲醛購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞懸液的制備。

用一次性注射器，按抗凝劑與血淋巴體積1∶1從文蛤或菲律賓蛤仔后閉殼肌處分別抽取血淋巴，迅速混勻后轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管中，加入等體積的4%甲醛溶液分散重懸，冰浴固定5 min，經(jīng)PBS洗滌后用吸頭小心吹散，4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 顯微鏡觀察。

將上述2種貝類血細(xì)胞細(xì)胞懸液分別制備滴片，用Leica DM5000型顯微鏡觀察、照相，根據(jù)胞內(nèi)可辨顆粒的大小和含量差異對(duì)細(xì)胞歸類，并進(jìn)行相關(guān)的統(tǒng)計(jì)和分析。

1.2.3 圖像流式細(xì)胞儀測(cè)量。

試驗(yàn)所用的圖像流式細(xì)胞儀為Merck Millipore公司的FlowSight型，具有全新設(shè)計(jì)的管路系統(tǒng)，適宜各種混合樣品的快速分析，不易堵柱，同時(shí)可以采集每個(gè)樣品在明場(chǎng)及暗場(chǎng)各通道的實(shí)時(shí)圖像，便于比對(duì)印證，省去了回收檢測(cè)的操作。將前述固定、洗滌處理的細(xì)胞懸液經(jīng)70 μm細(xì)胞篩過(guò)濾，去除黏連細(xì)胞團(tuán)，上機(jī)檢測(cè)，每個(gè)樣品采集30 000個(gè)樣點(diǎn)的測(cè)量數(shù)據(jù)和圖像，使用IDEAS Application軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 文蛤和菲律賓蛤仔血細(xì)胞的顯微觀察和分類

文蛤和菲律賓蛤仔血細(xì)胞的形態(tài)在顯微鏡下很相似，主要為橢圓形或近圓形，大小也較接近，部分細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)明顯的顆粒結(jié)構(gòu)，可以根據(jù)顆粒大小和數(shù)量將2種貝類血細(xì)胞分為無(wú)顆粒細(xì)胞、小顆粒細(xì)胞和大顆粒細(xì)胞3種。無(wú)顆粒細(xì)胞以胞內(nèi)沒(méi)有明顯可辨的顆粒為特征，細(xì)胞核清晰易辨。小顆粒細(xì)胞內(nèi)含有數(shù)量不等的細(xì)小的顆粒，粒徑約占細(xì)胞直徑的5%～10%，顆粒數(shù)量范圍變化較大，部分細(xì)胞核被顆粒遮擋。大顆粒細(xì)胞內(nèi)則多充滿大型顆粒，粒徑通常較均勻，約為細(xì)胞直徑的10%左右，細(xì)胞核多被顆粒完全遮擋（圖1）。分類統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，2種貝類的無(wú)顆粒細(xì)胞占比統(tǒng)計(jì)較為接近，含有顆粒的血細(xì)胞在2種貝類血液中的占比均較大，其中文蛤的大顆粒細(xì)胞及菲律賓蛤仔的小顆粒細(xì)胞含量在各自全部血細(xì)胞中的占比均超過(guò)50%（表1）。

2.2 文蛤和菲律賓蛤仔血細(xì)胞的圖像流式測(cè)量和分類

采用圖像流式細(xì)胞儀測(cè)量文蛤和菲律賓蛤仔的血細(xì)胞及顆粒特征，所反映的是貝類血細(xì)胞內(nèi)全部顆粒及其結(jié)構(gòu)的綜合差異。通過(guò)對(duì)比各項(xiàng)測(cè)量參數(shù)和分析策略，確定優(yōu)化方案如下：以側(cè)向散射強(qiáng)度和面積為橫坐標(biāo)、縱坐標(biāo)繪圖，根據(jù)單細(xì)胞樣點(diǎn)聚集情況劃定各類群設(shè)門邊界，并結(jié)合同步采集的圖像進(jìn)行比較分析。2種貝類血細(xì)胞類群分布具有明顯的一致性，均可聚集為4個(gè)類群，且邊界清晰。綜合量化分析獲得的顆粒特征及輔助圖像，將2種貝類的血細(xì)胞劃定為無(wú)顆粒細(xì)胞、小顆粒細(xì)胞、中顆粒細(xì)胞和大顆粒細(xì)胞4種，分別用R1、R2、R3和R4表示（圖2）。R1類群位于散點(diǎn)圖底部，散射面積極小，說(shuō)明幾乎不含顆粒結(jié)構(gòu)，屬于無(wú)顆粒細(xì)胞。同步采集的圖像顯示胞內(nèi)缺乏折光物質(zhì)。R2類群的側(cè)向散射面積較大，但強(qiáng)度相對(duì)略低，表明其中含有較多顆粒，但顆粒結(jié)構(gòu)總體不夠復(fù)雜，屬于小顆粒細(xì)胞;輔助圖像表明胞內(nèi)具有較明顯的折光組分。R3類群側(cè)向散射面積不大，但具有較大的側(cè)散強(qiáng)度表明其胞內(nèi)的顆粒占比不大，但結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，歸為中顆粒細(xì)胞;同步獲得的圖像提示其中可見(jiàn)顆粒不顯著，但折光性很強(qiáng)，與側(cè)向散射的測(cè)量提示吻合。R4類群位于散點(diǎn)圖右上方，表明胞內(nèi)富含顆粒且顆粒結(jié)構(gòu)最復(fù)雜，屬于大顆粒細(xì)胞，其側(cè)向散射通道的圖像也可見(jiàn)胞內(nèi)充滿高折光物質(zhì)。以無(wú)顆粒細(xì)胞的平均大小為基準(zhǔn)，分別測(cè)量、對(duì)比各類細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，2種貝類中的4種血細(xì)胞都呈現(xiàn)出從R1到R4類型逐漸增大的趨勢(shì)。另外，文蛤和菲律賓蛤仔的各類群細(xì)胞比例存在較大差異，前者無(wú)顆粒細(xì)胞占比很小，其他3類細(xì)胞比例較為接近，后者血淋巴中以無(wú)顆粒和小顆粒細(xì)胞占比較大（表2）。

3 結(jié)論與討論

由于分析方法差異，貝類的血細(xì)胞分類一直存在不同的觀點(diǎn)，同一種貝類的細(xì)胞種類和比例在不同研究中也有差異，其中一個(gè)主要原因就是缺乏一致認(rèn)同的量化標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)于以功能研究為目標(biāo)的血細(xì)胞分類分析來(lái)說(shuō)，基于細(xì)胞表面抗原特征的檢測(cè)方法是較為通用的，但無(wú)脊椎動(dòng)物血液研究方面缺乏特定的分類抗體，因此嚴(yán)重制約了其細(xì)分功能的深入分析。

流式測(cè)量是目前較為有效的定量方法，但常規(guī)流式受限于其測(cè)量參數(shù)和測(cè)量范圍，對(duì)無(wú)脊椎動(dòng)物血細(xì)胞分析尚在摸索階段。該研究比較了常規(guī)顯微觀察與新型流式細(xì)胞儀對(duì)文蛤及菲律賓蛤仔血細(xì)胞的分類情況。2種方法都能夠根據(jù)細(xì)胞內(nèi)顆粒狀況將血細(xì)胞分為不同的類群，但分類結(jié)果不盡相同。顯微觀察是最為常用的分類手段，通過(guò)對(duì)血細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)顆粒的大小及含量的人工辨識(shí)來(lái)區(qū)分細(xì)胞類別，2種貝類的血細(xì)胞都可據(jù)此分為無(wú)顆粒細(xì)胞，小顆粒細(xì)胞及大顆粒細(xì)胞3種，其中含有顆粒的細(xì)胞總數(shù)占比很大，與Chang等[7]和劉東武等[8]對(duì)文蛤和菲律賓蛤仔的觀察結(jié)果相近，但Zhang等[9]和王文琪等[10]對(duì)上述2種貝類血細(xì)胞的觀察均顯示不含顆粒的細(xì)胞占比較大。產(chǎn)生這種差異的原因與目前尚缺乏統(tǒng)一的顯微觀察判定標(biāo)準(zhǔn)有關(guān)，因此此次檢測(cè)的結(jié)果受主觀判斷波動(dòng)的影響較大，這也提示需要用更準(zhǔn)確的量化標(biāo)準(zhǔn)來(lái)分析血細(xì)胞類群。

與顯微觀察對(duì)比，該研究首次將一種新型圖像流式細(xì)胞儀用于貝類血細(xì)胞的測(cè)量和分析。針對(duì)顆粒特征，該儀器除了能分析前向散射及側(cè)向散射的高、寬、面積外，還能測(cè)量強(qiáng)度等重要參數(shù)，因此與常規(guī)流式細(xì)胞儀相比更適合開(kāi)展探究性工作。通過(guò)綜合比較各種分析策略，確定了依據(jù)側(cè)向散射強(qiáng)度及面積的綜合差異區(qū)分細(xì)胞類型的優(yōu)化方案，能夠?qū)⒑蓄w粒的細(xì)胞更清晰地分為小顆粒細(xì)胞、中顆粒細(xì)胞及大顆粒細(xì)胞3種。精確測(cè)量也進(jìn)一步印證了顯微觀察結(jié)果，即2種貝類的血淋巴中含有顆粒的細(xì)胞占比較大。大量研究[11-14]表明，甲殼動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)也具有類似的顆粒，有些還有膜結(jié)構(gòu)包裹，因此其側(cè)向散射信號(hào)應(yīng)該來(lái)源于這些顆粒中所包含的物質(zhì)。由于側(cè)向散射是對(duì)胞內(nèi)全部折光結(jié)構(gòu)的測(cè)量，既包括前述可見(jiàn)顆粒中的，又包括胞質(zhì)內(nèi)難以辨識(shí)的細(xì)小結(jié)構(gòu)，所以能更客觀地反映細(xì)胞內(nèi)的顆粒的總體差異。晉偉等[15]提出應(yīng)將新型檢測(cè)手段用于水生動(dòng)物血細(xì)胞自動(dòng)化“驗(yàn)血”分析。常規(guī)流式細(xì)胞儀可用于多種貝類的血細(xì)胞分析[16-22]，但受限于測(cè)量模塊，大多僅能將血細(xì)胞分為2～3類，占比各不相同，類群邊界也不夠清晰;胡錦麗等[23-24]利用圖像流式細(xì)胞儀首次以精確的定量標(biāo)準(zhǔn)將甲殼動(dòng)物血細(xì)胞清晰分為4類，各類細(xì)胞的體積呈現(xiàn)出與該研究一致的由R1類型向R4類型逐漸增大的變化趨勢(shì)。微球吞噬試驗(yàn)結(jié)果顯示，各類細(xì)胞均具有吞噬功能，而以無(wú)顆粒及小顆粒細(xì)胞為主要吞噬類群。該研究首次將新型流式細(xì)胞儀引入貝類血細(xì)胞分析，用側(cè)向散射強(qiáng)度和面積差異區(qū)分出了4種血細(xì)胞，邊界清晰。對(duì)比甲殼動(dòng)物的血細(xì)胞圖像流式分析可見(jiàn)，基于血藍(lán)蛋白攜氧的多種無(wú)脊椎動(dòng)物的血細(xì)胞都能夠以側(cè)向散射強(qiáng)度和面積差異分為4個(gè)類群，而且散點(diǎn)圖的設(shè)門模式十分接近，提示不同進(jìn)化階段的物種之間在血細(xì)胞功能方面也應(yīng)具有一定的相似性。此外，就某一動(dòng)物而言，其血細(xì)胞的4個(gè)類群之間普遍缺乏過(guò)渡樣點(diǎn)，也進(jìn)一步提示細(xì)胞類群之沒(méi)有相互轉(zhuǎn)化，至少在外周血中彼此獨(dú)立，每種細(xì)胞具有明確的功能。例如，無(wú)顆粒細(xì)胞以其較為疏松的胞質(zhì)空間承載吞噬的異物，而各種顆粒細(xì)胞則生成特定的功能分子，儲(chǔ)存于顆粒結(jié)構(gòu)中，或以量化的方式分泌到循環(huán)系統(tǒng)，調(diào)節(jié)各類血細(xì)胞和機(jī)體的功能。

目前，針對(duì)多種貝類的血細(xì)胞分類的研究結(jié)果存在一些差異，一方面是各種血細(xì)胞的比例在不同貝類中不同;另一方面是因?yàn)獒槍?duì)同一種貝類的血細(xì)胞類群組成，采用不同分析方法所獲得的結(jié)果也不盡相同。前者體現(xiàn)了物種差異及動(dòng)物與所在環(huán)境的適應(yīng)關(guān)系等，而后者則提示各種方法依據(jù)不同的特征差異都可對(duì)血細(xì)胞進(jìn)行區(qū)分，但以更精準(zhǔn)的量化標(biāo)準(zhǔn)作為分類依據(jù)才能讓各項(xiàng)研究具有可比性，從而挖掘出更準(zhǔn)確的規(guī)律。這一點(diǎn)在醫(yī)學(xué)血液學(xué)分類研究中最為明顯，從早期僅能簡(jiǎn)單區(qū)分紅細(xì)胞與白細(xì)胞，到現(xiàn)今依靠各種細(xì)胞分化抗原辨識(shí)更為精細(xì)的細(xì)胞類群，經(jīng)歷了長(zhǎng)時(shí)間的發(fā)展完善，并推動(dòng)了免疫細(xì)胞功能研究的持續(xù)深入，為疾病的檢測(cè)、預(yù)防和治療提供了基礎(chǔ)性的支撐。因此，隨著新技術(shù)與新方法的不斷完善，貝類血細(xì)胞會(huì)有更多類群被鑒定出來(lái)，該研究在自動(dòng)化定量分類方面提供了一種新的策略，有助于推動(dòng)該目標(biāo)的實(shí)現(xiàn)。

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