潘偉一 韓菊 沈洪艷

摘要 [目的]探究PFOS對(duì)斑馬魚(yú)神經(jīng)和能量代謝的影響。[方法]該研究采用室內(nèi)暴露試驗(yàn)方法，將斑馬魚(yú)暴露于0、0.56、1.67、5.00、15.00 mg/L濃度的PFOS試驗(yàn)液中，測(cè)定斑馬魚(yú)體內(nèi)AchE活性和LDH活性，試驗(yàn)周期為15 d。[結(jié)果]PFOS對(duì)斑馬魚(yú)頭部AchE活性有誘導(dǎo)作用，0.56、1.67 mg/L低濃度暴露組對(duì)AchE活性表現(xiàn)為誘導(dǎo)作用，而5.00、15.00 mg/L高濃度暴露組與低濃度暴露組相比，PFOS對(duì)AchE活性有抑制作用。PFOS對(duì)斑馬魚(yú)肌肉組織LDH活性表現(xiàn)為先誘導(dǎo)后抑制的作用，與對(duì)照組相比，在暴露前6 d PFOS誘導(dǎo)斑馬魚(yú)體內(nèi)LDH活性，促進(jìn)了斑馬魚(yú)能量代謝，從暴露第9天到試驗(yàn)結(jié)束，斑馬魚(yú)體內(nèi)LDH活性受到抑制，能量代謝減弱，且隨著暴露濃度的升高，抑制作用越明顯，呈現(xiàn)劑量—效應(yīng)關(guān)系。[結(jié)論]在整個(gè)試驗(yàn)周期內(nèi)，與對(duì)照組相比PFOS可以誘導(dǎo)AchE活性，抑制興奮的傳遞從而破壞神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)，暴露9 d后，PFOS對(duì)AchE活性的誘導(dǎo)作用隨著暴露濃度的升高而減弱。PFOS短期暴露可促進(jìn)斑馬魚(yú)能量代謝能力，長(zhǎng)期暴露抑制斑馬魚(yú)無(wú)氧代謝。

關(guān)鍵詞 全氟辛烷磺酸;斑馬魚(yú);神經(jīng)系統(tǒng);能量代謝;AchE;LDH

Abstract [Objective]To have a better understanding of the toxicity effect of PFOS to zebrafish nerve and energy metabolism.[Method]Indoor exposure test was conducted.Zebrafish was exposed to PFOS at different concentrations of 0，0.56，1.67，5.00，15.00 mg/L，respectively.[Result]After 15 days，the results showed that the AchE was induced by PFOS，the 0.56，1.67mg/L lower concentration groups induced the AchE，but compared with lower concentration groups，5.00，15.00 mg/L groups inhibited the activity of AchE.The activity of LDH was increased firstly and then decreased.After exposure for 6 days，the LDH was induced by PFOS，and promoted zebrafish energy metabolism.Until the end of the experiment，the activity of LDH is subjected，and reduced energy metabolism.There is a concentrationeffect relationship between PFOS and the zebrafish energy metabolism.[Conclusion]All the results indicated that throughout the experimental cycle，compared with the control group，PFOS can induce AchE activity and damage nervous system.After exposure for 9 days，the induction of AchE activity by PFOS decreased with the increase of exposure concentration.Shortterm exposure to PFOS can promote zebrafish energy metabolism，and longterm exposure can inhibit zebrafish anaerobic metabolism.

Key words PFOS;Zebrafish;Nerve;Energy metabolism;AchE;LDH

全氟辛烷磺酸（perfluorooctane sulfonate ，PFOS）是一種應(yīng)用廣泛的新型持久性有機(jī)污染物[1]。PFOS化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有C-F化學(xué)鍵，使其具有較強(qiáng)的熱、化學(xué)穩(wěn)定性以及疏水、疏脂等特性[2]，被廣泛用于紡織品、地毯、皮革制品和家具等表面防污處理劑的生產(chǎn)中，同時(shí)可作為中間體用于生產(chǎn)涂料、泡沫滅火劑、地板上光劑、農(nóng)藥和滅白蟻藥劑等[3]，所以PFOS在世界各大水系及我國(guó)長(zhǎng)江、珠江、黃浦江、嘉陵江以及三峽庫(kù)區(qū)等水體中均有檢出[4-5]，PFOS在北大西洋中的濃度范圍是8.6～36 pg/L[6]，在我國(guó)東江流域濃度為0.97 ng/L[7]，在黃浦江濃度達(dá)20.5 ng/L[5，8]，PFOS可以通過(guò)呼吸作用和進(jìn)食被生物體攝取，并具有毒性作用[9]，其毒性作用在食物鏈傳遞中被放大，易在生物體內(nèi)富集并難以分解[10-11]。

PFOS具有免疫毒性，可降低小鼠淋巴細(xì)胞增殖功能和NK細(xì)胞活性[12]，PFOS早期低劑量慢性暴露可引起大鼠成年后學(xué)習(xí)記憶力減退，海馬神經(jīng)發(fā)育不足，組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，引起海馬環(huán)路的損傷[13]，還能改變中華倒刺鲃?dòng)佐~(yú)能量代謝水平的下限[14]。但PFOS對(duì)生物神經(jīng)毒性效應(yīng)和能量代謝的影響還有待進(jìn)一步研究，因此該研究選取斑馬魚(yú)為受試生物，研究水體中PFOS對(duì)乙酰膽堿酯酶（AchE）、乳酸脫氫酶（LDH）的影響，為PFOS對(duì)水生生物亞急性毒性提供毒理學(xué)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

所用斑馬魚(yú)購(gòu)自某生物研究所，AchE、LDH檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，PFOS試劑購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，其余試劑均為分析純。

試驗(yàn)儀器包括移液槍?zhuān)≒ipet-Lite，TopPette Pipettor）、溫度計(jì)、玻璃勻漿器、量筒、燒杯、5 L玻璃燒杯、低溫冰箱（BBC-226STV）、曝氣泵、恒溫水浴鍋（HH-4）、精密電子天平（JJ323BC）、臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（2-16PK）、酶標(biāo)儀（Spectramax190）。

1.2 方法

1.2.1 毒性試驗(yàn)。試驗(yàn)用魚(yú)試驗(yàn)前在充分曝氣的自來(lái)水中馴養(yǎng)15 d，以充分適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境，馴養(yǎng)期間斑馬魚(yú)自然死亡率低于2%，并在試驗(yàn)前24 h停止喂養(yǎng)。為保證受試生物在試驗(yàn)過(guò)程中不死亡，設(shè)置試驗(yàn)最高暴露組濃度為96 h半致死濃度的1/5，根據(jù)急性毒性試驗(yàn)結(jié)果，PFOS 96 h LC50為75.864 mg/L，所以設(shè)置該試驗(yàn)暴露組濃度為0、0.56、1.67、5.00、15.00 mg/L，并設(shè)置溶劑對(duì)照組，每個(gè)暴露組設(shè)3個(gè)平行，重復(fù)3次試驗(yàn)，采用靜態(tài)試驗(yàn)的方法，試驗(yàn)期間，在玻璃魚(yú)缸中分別加入4 L對(duì)應(yīng)濃度的試驗(yàn)液體，將馴養(yǎng)后的斑馬魚(yú)投放至各暴露組，每組25條，于暴露后的第3、6、9、12、15天，將斑馬魚(yú)頭部剪掉保留，內(nèi)臟等內(nèi)部器官取出保留肌肉組織，并分別對(duì)斑馬魚(yú)頭部和肌肉組織進(jìn)行稱(chēng)重，加入組織重量9倍的生理鹽水進(jìn)行研磨、離心，按照試劑盒要求將樣品稀釋至相應(yīng)倍數(shù)后測(cè)定斑馬魚(yú)頭部AchE活力、肌肉組織中LDH活性。

1.2.2 數(shù)據(jù)處理。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2010進(jìn)行處理;作圖使用Origin 8.6;使用GraphPad Prism 5對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，與對(duì)照組相比，P<0.05表示差異顯著，標(biāo)記為*，P<0.01表示差異極顯著，標(biāo)記為。

2 結(jié)果與分析

2.1 PFOS對(duì)斑馬魚(yú)頭部AchE活力的影響

乙酰膽堿酯酶（AchE）是生物神經(jīng)傳導(dǎo)的關(guān)鍵酶，目前已成為反映水生生物受到污染物脅迫危害程度的經(jīng)典毒理學(xué)指標(biāo)[15]，AchE廣泛存在于各種動(dòng)物組織中，在神經(jīng)突觸間隙中，通過(guò)催化水解乙酰膽堿來(lái)終止其對(duì)膽堿受體的興奮作用，維持神經(jīng)沖動(dòng)的正常傳遞，AchE活性升高則抑制興奮的傳遞，活性降低則使生物體表現(xiàn)為過(guò)度興奮 [16-17]。各暴露組PFOS對(duì)斑馬魚(yú)頭部AchE活性的影響見(jiàn)圖1。

由圖1可知，在整個(gè)試驗(yàn)周期內(nèi)溶劑對(duì)照組與空白組斑馬魚(yú)頭部AchE活性無(wú)顯著差異，且趨于一致，由此判定助溶劑對(duì)斑馬魚(yú)毒性可忽略不計(jì)，不影響PFOS對(duì)AchE活性的毒性效應(yīng)。在整個(gè)試驗(yàn)周期內(nèi)，與對(duì)照組相比，PFOS對(duì)斑馬魚(yú)頭部AchE活性均表現(xiàn)為誘導(dǎo)作用。暴露第3天，各暴露組AchE活性均顯著高于對(duì)照組，其中15.00 mg/L暴露組AchE活性出現(xiàn)顯著差異（P<0.05），AchE活性值為1.11 U/mg，且隨著暴露濃度的升高，PFOS對(duì)斑馬魚(yú)AchE活性誘導(dǎo)作用越明顯，有明顯的劑量—效應(yīng)關(guān)系。AchE活性高于對(duì)照組，表明PFOS對(duì)斑馬魚(yú)頭部AchE有誘導(dǎo)作用，致使神經(jīng)突觸間隙中乙酰膽堿數(shù)量減少，從而抑制了興奮的傳遞。暴露第6天，1.67、5.00 mg/L暴露組AchE活性高于對(duì)照組但無(wú)顯著差異，但0.56、15.00暴露組AchE活性顯著高于對(duì)照組（P<0.05）。暴露至第9天，各暴露組AchE活性均高于對(duì)照組，但15.00 mg/L的高濃度暴露組AchE活性低于0.56、1.67 mg/L 的低濃度暴露組。暴露至第12和15天，除15.00 mg/L暴露組外，其余各暴露組AchE活性均高于對(duì)照組。其中5.00、15.00暴露組AchE活性均低于1.67 mg/L暴露組，這表明雖然PFOS對(duì)AchE活性有誘導(dǎo)作用，但當(dāng)暴露濃度高于1.67 mg/L 時(shí)，與其余低濃度暴露組相比，PFOS對(duì)AchE活性表現(xiàn)為抑制作用，證明暴露一定時(shí)間后，PFOS對(duì)AchE活性的誘導(dǎo)作用隨著暴露濃度的升高而減弱。Xiaochun Guo等[18]研究發(fā)現(xiàn)，全氟化合物可破壞斑馬魚(yú)神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)、抑制神經(jīng)元發(fā)育，余向陽(yáng)等[19]研究發(fā)現(xiàn)，毒死蜱和三唑磷對(duì)斑馬魚(yú)頭部AchE活性均有抑制作用，且隨著暴露濃度的增加、暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)AChE活性抑制作用越明顯，與該文中暴露前6 d PFOS對(duì)AchE活性作用結(jié)果及PFOS通過(guò)誘導(dǎo)AchE活性，間接影響神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿的數(shù)量，破壞神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)的結(jié)論一致。

2.2 PFOS對(duì)斑馬魚(yú)肌肉組織LDH活性的影響

乳酸脫氫酶（LDH）在肌體能量代謝過(guò)程中起重要作用，其活性的改變可以間接反映肌體能量代謝情況[20-21]。生物體正常條件下，LDH含量較低，當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)能量代謝障礙或者細(xì)胞損傷時(shí)，LDH的含量會(huì)升高[22-23]。各暴露組PFOS對(duì)斑馬魚(yú)肌肉組織LDH含量的影響見(jiàn)圖2。

由圖2可知，在整個(gè)暴露周期內(nèi)，PFOS對(duì)斑馬魚(yú)體內(nèi)LDH活性表現(xiàn)為先誘導(dǎo)后抑制的作用。在暴露第3天，各暴露組LDH活性均高于對(duì)照組，其中15.00 mg/L暴露組LDH活性與對(duì)照組相比表現(xiàn)顯著差異（P<0.05），這表明斑馬魚(yú)肌體為了應(yīng)對(duì)PFOS刺激，以增加LDH活性的方式來(lái)增加肌體能量代謝[17]，同時(shí)斑馬魚(yú)細(xì)胞可能受到損傷。暴露至第6天，各暴露組LDH活性變化同第3天類(lèi)似，其中0.56和15.00 mg/L 暴露組LDH活性顯著高于對(duì)照組（P<0.05）。暴露至第9天，0.56、1.67、5.00 mg/L暴露組LDH活性顯著低于對(duì)照組，其中0.56、1.67 mg/L暴露組與對(duì)照組間差異極顯著（P<0.01），5.00 mg/L暴露組與對(duì)照組間差異顯著（P<0.05），此時(shí)PFOS對(duì)斑馬魚(yú)體內(nèi)LDH活性表現(xiàn)為抑制作用，原因可能是斑馬魚(yú)持續(xù)受到PFOS脅迫，導(dǎo)致斑馬魚(yú)肌體無(wú)氧代謝能力減弱。暴露至第12天，0.56、1.67、5.00 mg/L暴露組LDH活性依然顯著低于對(duì)照組（P<0.05）。暴露至第15天，15.00 mg/L暴露組與空白組相比出現(xiàn)了顯著差異（P<0.01），各暴露組斑馬魚(yú)機(jī)體內(nèi)LDH活性均低于空白組，且隨著暴露組濃度的升高，LDH活性顯著降低（P<0.01），呈現(xiàn)劑量—效應(yīng)關(guān)系。分析原因可能是受到PFOS脅迫后，斑馬魚(yú)肌體能量代謝增強(qiáng)以應(yīng)對(duì)PFOS對(duì)肌體造成的損傷，但隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，增加能量代謝并不能消除PFOS帶來(lái)的不利效應(yīng)，且這種效應(yīng)對(duì)斑馬魚(yú)肌體造成損傷，致使斑馬魚(yú)肌體能量代謝減慢。謝松等[21]發(fā)現(xiàn)，三硝基甲苯對(duì)LDH活性有抑制作用，與該研究中暴露9 d后LDH活性變化趨勢(shì)相近。

3 結(jié)論

（1）在整個(gè)試驗(yàn)周期內(nèi)，PFOS通過(guò)誘導(dǎo)斑馬魚(yú)頭部AchE活性，使乙酰膽堿的數(shù)量減少，抑制興奮的傳遞從而破壞神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)。與對(duì)照組相比，PFOS對(duì)斑馬魚(yú)頭部AchE活性均表現(xiàn)為誘導(dǎo)作用。暴露9 d以后，PFOS對(duì)AchE活性的誘導(dǎo)作用隨著暴露濃度的升高而減弱。

（2）在暴露前6 d，PFOS對(duì)斑馬魚(yú)體內(nèi)LDH活性表現(xiàn)為誘導(dǎo)作用，從暴露第9天到暴露結(jié)束，PFOS對(duì)斑馬魚(yú)體內(nèi)LDH活性表現(xiàn)為抑制作用，且隨著暴露組濃度的升高，抑制作用越明顯，呈現(xiàn)劑量—效應(yīng)關(guān)系。PFOS短時(shí)間（暴露前6 d）暴露可促進(jìn)斑馬魚(yú)能量代謝能力，長(zhǎng)時(shí)間（暴露第6天到試驗(yàn)結(jié)束）暴露使斑馬魚(yú)無(wú)氧代謝能力減弱。

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