王風義,王 輝
(1.綏化學院 食品與制藥工程學院,黑龍江 綏化 152000;2.山東勝利生物工程有限公司,山東 濟寧 272173)
4,5-咪唑二羧酸,又稱咪唑-4,5-二羧酸、4,5-咪唑二甲酸、4,5-二羧基咪唑,白色結晶性粉末。熔點約280℃(分解為咪唑和二氧化碳),溶于氨或堿溶液,不溶于水、乙醇、乙醚。主要用于合成用于合成頭孢咪唑等原料藥,也可用于配位化合物。由苯并咪唑開環(huán)氧化合成而得。其分析方法一般采用酸堿滴定化學法,由于4,5-咪唑二羧酸是較弱的二元酸,沒有合適的指示劑且電位突躍不明顯,其檢測結果的重復性較差。目前,4,5-咪唑二羧酸液相色譜分析方法沒有報道,所以,我們在多次實驗的基礎上,找到了給定的液相色譜分析的方法,本方法與之前的方法相比之下較為方便簡潔和快速精準,與雜質分離效果較好,在對4,5-咪唑二羧酸工業(yè)品的工業(yè)所需分析中,起到了重要作用,取得了令人滿意的結果。
甲醇(色譜純);磷酸(分析純);超純水;4,5-咪唑二羧酸標準品(98.5%)。
P230II型液相色譜儀(或其他型號的帶可變波長紫外檢測器的液相色譜儀);色譜工作站(或色譜數(shù)據(jù)處理機);酸度計;超聲波發(fā)生器。
色譜柱:250 mm×4.6 mm (i.d)不銹鋼柱,內裝sphersorb C1810 μm(或同種效果的色譜柱);流動相∶V(甲醇)∶V(水) = 50∶50,用磷酸調pH值2.0;流速:0.6 mL/ min;檢測波長:254 nm;柱溫:室溫;進樣量:10 μL。
圖1 樣品液相色譜圖
在給定的色譜條件下,4,5-咪唑二羧酸的保留時間為4.1 min。也可以對儀器中的參數(shù)進行適當?shù)恼{整,以此獲得更好地效果,典型色譜圖見圖1。
(1)標準溶液的配制:準確稱取0.06 g(準確至0.0001 g)4,5-咪唑二羧酸標準品于50 mL的容量瓶中,先加入約30 mL流動相,再逐滴加入0.5 mol/L的氫氧化鈉標準溶液,加滴加邊搖動,至溶液變澄清,超聲波振蕩后再用流動相定容,搖勻,經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后備用。
(2)樣品溶液的配制:準確稱取約含0.06 g(準確至0.0001 g)4,5-咪唑二羧酸的樣品于50 mL的容量瓶中,先加入約30 mL流動相,再逐滴加入0.5 mol/L的氫氧化鈉標準溶液,加滴加邊搖動,至溶液變澄清,超聲波振蕩后再用流動相定容,搖勻,0.45 μm濾膜過濾后待用。
(3)分析測定:在上述分析條件下,進標樣待色譜基線穩(wěn)定之后,直至相鄰兩針標樣溶液中4,5-咪唑二羧酸峰面積變化前后差距小于1.5%,按照一針標樣,兩針樣品,一針標樣的順序進行測定。
取兩針標樣溶液和兩針樣品溶液中4,5-咪唑二羧酸面積平均數(shù)。試樣中4,5-咪唑二羧酸的質量分數(shù)X(%)按式(1)計算:
(1)
式中:A1—標樣溶液中4,5-咪唑二羧酸峰面積的平均值;
A2—試樣溶液中4,5-咪唑二羧酸峰面積的平均值;
m1—4,5-咪唑二羧酸標樣的質量,g;
m2—試樣的質量,g;
P —標樣中4,5-咪唑二羧酸的質量分數(shù),%。
取之前配比好的少量4,5-咪唑二羧酸標樣,用流動相稀釋以后,用流動相作為參比,在200~260 nm波長范圍內,以每2 nm為一個階段測定一次吸光度,然后以波長為橫坐標,吸光度為縱坐標,建立4,5-咪唑二羧酸標樣吸收光譜曲線,如圖2,由曲線可知,4,5-咪唑二羧酸的最大吸收波長分別為216 nm和232 nm。在最大吸收波長下,其靈敏度太高,不利于樣品的稱量,為了便于稱樣,我們選擇254 nm作為檢測波長。
圖2 吸收光譜曲線
分別選擇了不同比例的甲醇和水為流動相,當甲醇與水比例為50∶50時,4,5-咪唑二羧酸標樣與雜質分離較好且保留時間較小,但峰拖尾,調節(jié)流動相的酸度可改變拖尾情況,以pH值2時拖尾較輕,峰形對稱度較好,所以我們選擇甲醇+水=50+50且以磷酸調pH值2為流動相進行分析,典型的色譜圖見圖1。
稱取0.01 g到0.09 g的標準品系列,按照實驗方法配制溶液,在給定的色譜分析條件下,每個標樣溶液進樣3次,以稱取的質量為橫坐標,三次進樣獲得的4,5-咪唑二羧酸標樣峰面積的平均值為縱坐標進行作圖,得到線性相關曲線圖,見圖3,并求得回歸直線方程為:A=267984m+1717.6,r2=0.9985,式中:A為峰面積,m為標樣質量,r為相關系數(shù)。
圖3 4,5-咪唑二羧酸線性相關曲線
對同一個4,5-咪唑二羧酸樣品,用給定的實驗方法測定6次,分析數(shù)據(jù)見表1,由表1可知,本方法的標準偏差為0.70,變異系數(shù)為0.73%。
表1 精密度的測定
按照添加回收率的測定方法,在已測得含量的樣品中,添加一定量的4,5-咪唑二羧酸標準品,用給定的實驗方法下進行分析,經(jīng)計算,方法的平均回收率為100.02%。
由以上結果和不同實驗室分析比對結果可知,本文給定的實驗方法適用于4,5-咪唑二羧酸的含量檢測。