王風義，王 輝

(1.綏化學院 食品與制藥工程學院，黑龍江 綏化 152000；2.山東勝利生物工程有限公司，山東 濟寧 272173)

4,5-咪唑二羧酸，又稱咪唑-4,5-二羧酸、4,5-咪唑二甲酸、4,5-二羧基咪唑，白色結晶性粉末。熔點約280℃(分解為咪唑和二氧化碳)，溶于氨或堿溶液，不溶于水、乙醇、乙醚。主要用于合成用于合成頭孢咪唑等原料藥，也可用于配位化合物。由苯并咪唑開環(huán)氧化合成而得。其分析方法一般采用酸堿滴定化學法，由于4,5-咪唑二羧酸是較弱的二元酸，沒有合適的指示劑且電位突躍不明顯，其檢測結果的重復性較差。目前，4,5-咪唑二羧酸液相色譜分析方法沒有報道，所以，我們在多次實驗的基礎上，找到了給定的液相色譜分析的方法，本方法與之前的方法相比之下較為方便簡潔和快速精準，與雜質分離效果較好，在對4,5-咪唑二羧酸工業(yè)品的工業(yè)所需分析中，起到了重要作用，取得了令人滿意的結果。

1 實驗部分

1.1 試劑

甲醇(色譜純)；磷酸(分析純)；超純水；4,5-咪唑二羧酸標準品(98.5%)。

1.2 儀器

P230II型液相色譜儀(或其他型號的帶可變波長紫外檢測器的液相色譜儀)；色譜工作站(或色譜數(shù)據(jù)處理機)；酸度計；超聲波發(fā)生器。

1.3 操作條件

色譜柱：250 mm×4.6 mm (i.d)不銹鋼柱，內裝sphersorb C1810 μm(或同種效果的色譜柱)；流動相∶V(甲醇)∶V(水) = 50∶50，用磷酸調pH值2.0；流速：0.6 mL/ min；檢測波長：254 nm；柱溫：室溫；進樣量：10 μL。

圖1 樣品液相色譜圖

在給定的色譜條件下，4,5-咪唑二羧酸的保留時間為4.1 min。也可以對儀器中的參數(shù)進行適當?shù)恼{整，以此獲得更好地效果，典型色譜圖見圖1。

1.4 實驗方法

(1)標準溶液的配制：準確稱取0.06 g(準確至0.0001 g)4,5-咪唑二羧酸標準品于50 mL的容量瓶中，先加入約30 mL流動相，再逐滴加入0.5 mol/L的氫氧化鈉標準溶液，加滴加邊搖動，至溶液變澄清，超聲波振蕩后再用流動相定容，搖勻，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后備用。

(2)樣品溶液的配制：準確稱取約含0.06 g(準確至0.0001 g)4,5-咪唑二羧酸的樣品于50 mL的容量瓶中，先加入約30 mL流動相，再逐滴加入0.5 mol/L的氫氧化鈉標準溶液，加滴加邊搖動，至溶液變澄清，超聲波振蕩后再用流動相定容，搖勻，0.45 μm濾膜過濾后待用。

(3)分析測定：在上述分析條件下，進標樣待色譜基線穩(wěn)定之后，直至相鄰兩針標樣溶液中4,5-咪唑二羧酸峰面積變化前后差距小于1.5%，按照一針標樣，兩針樣品，一針標樣的順序進行測定。

1.5 計算

取兩針標樣溶液和兩針樣品溶液中4,5-咪唑二羧酸面積平均數(shù)。試樣中4,5-咪唑二羧酸的質量分數(shù)X(%)按式(1)計算：

(1)

式中：A1—標樣溶液中4,5-咪唑二羧酸峰面積的平均值；

A2—試樣溶液中4,5-咪唑二羧酸峰面積的平均值；

m1—4,5-咪唑二羧酸標樣的質量，g；

m2—試樣的質量，g；

P —標樣中4,5-咪唑二羧酸的質量分數(shù)，%。

2 結果與討論

2.1 吸收光譜曲線和檢測波長的選擇

取之前配比好的少量4,5-咪唑二羧酸標樣，用流動相稀釋以后，用流動相作為參比，在200～260 nm波長范圍內，以每2 nm為一個階段測定一次吸光度，然后以波長為橫坐標，吸光度為縱坐標，建立4,5-咪唑二羧酸標樣吸收光譜曲線，如圖2，由曲線可知，4,5-咪唑二羧酸的最大吸收波長分別為216 nm和232 nm。在最大吸收波長下，其靈敏度太高，不利于樣品的稱量，為了便于稱樣，我們選擇254 nm作為檢測波長。

圖2 吸收光譜曲線

2.2 流動相的選擇

分別選擇了不同比例的甲醇和水為流動相，當甲醇與水比例為50∶50時，4,5-咪唑二羧酸標樣與雜質分離較好且保留時間較小，但峰拖尾，調節(jié)流動相的酸度可改變拖尾情況，以pH值2時拖尾較輕，峰形對稱度較好，所以我們選擇甲醇+水=50+50且以磷酸調pH值2為流動相進行分析，典型的色譜圖見圖1。

2.3 線性范圍的測定

稱取0.01 g到0.09 g的標準品系列，按照實驗方法配制溶液，在給定的色譜分析條件下，每個標樣溶液進樣3次，以稱取的質量為橫坐標，三次進樣獲得的4,5-咪唑二羧酸標樣峰面積的平均值為縱坐標進行作圖，得到線性相關曲線圖，見圖3，并求得回歸直線方程為：A=267984m+1717.6，r2=0.9985，式中：A為峰面積，m為標樣質量，r為相關系數(shù)。

圖3 4,5-咪唑二羧酸線性相關曲線

2.4 精密度的測定

對同一個4,5-咪唑二羧酸樣品，用給定的實驗方法測定6次，分析數(shù)據(jù)見表1，由表1可知，本方法的標準偏差為0.70，變異系數(shù)為0.73%。

表1 精密度的測定

2.5 準確度的測定

按照添加回收率的測定方法，在已測得含量的樣品中，添加一定量的4,5-咪唑二羧酸標準品，用給定的實驗方法下進行分析，經(jīng)計算，方法的平均回收率為100.02%。

由以上結果和不同實驗室分析比對結果可知，本文給定的實驗方法適用于4,5-咪唑二羧酸的含量檢測。