楊永鋒，張子穎，劉國(guó)順，張書(shū)偉，楊欣玲，殷全玉，孫溢明，于建春*

1. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草行業(yè)煙草栽培重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 河南省生物炭工程技術(shù)研究中心，鄭州市文化路95 號(hào) 450002 2. 河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，鄭州經(jīng)濟(jì)技術(shù)開(kāi)發(fā)區(qū)第三大街8 號(hào) 450000

煙草種植是一種產(chǎn)質(zhì)量并重的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過(guò)程。部分煙葉產(chǎn)區(qū)多年連作、不合理施用化肥導(dǎo)致植煙土壤微生物種群失衡、生物活性降低［1-2］。生物炭（Biochar）是由生物有機(jī)物料（生物質(zhì)）在高溫、缺氧或低氧條件下裂解形成的一種含碳量極高的產(chǎn)物［3］，具有較好的物理結(jié)構(gòu)和耐降解等特點(diǎn)［4-6］。高碳基肥料是以生物炭為主要原料的有機(jī)肥，近年來(lái)在植煙土壤改良中應(yīng)用廣泛。常棟等［7］研究表明，在煙田土壤中施用生物炭基肥料可提高土壤肥力、同時(shí)提高植煙土壤微生物的碳源利用能力及其功能多樣性。張志浩等［8］研究發(fā)現(xiàn)，施用高碳基肥料能夠調(diào)節(jié)植煙土壤理化性質(zhì)及微生物群落結(jié)構(gòu)，同時(shí)還有促進(jìn)烤煙生長(zhǎng)、改善烤后煙葉品質(zhì)的作用。木霉屬（Trichoderma spp.）真菌在自然界中廣泛存在且能夠與土壤、植物根系及葉面相互作用［9］，已被作為生物防治劑用于植物病害的生物防治［10］，在20 世紀(jì)90 年代已用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中［11］。綠色木霉（Trichoderma viride）作為一種生防菌劑，其拮抗作用表現(xiàn)出廣譜抗病和機(jī)制多樣的特點(diǎn)［12］。有研究表明，綠色木霉在拮抗病原菌［13-14］、防治植物病害［15-16］及促進(jìn)作物生長(zhǎng)發(fā)育［17］方面有良好效果。綠色木霉在煙草生產(chǎn)上的應(yīng)用也較為廣泛，王革等［18-19］研究表明，綠色木霉能在烤煙葉面及根部定殖，通過(guò)生長(zhǎng)競(jìng)爭(zhēng)、分泌抗菌素類(lèi)物質(zhì)及寄生作用可拮抗煙草赤星病菌，提高烤煙抗病性及土壤養(yǎng)分利用率；端永明等［20］研究發(fā)現(xiàn)，葉面噴施綠色木霉能夠提高烤煙煙苗素質(zhì)、促進(jìn)烤煙田間的生長(zhǎng)發(fā)育且對(duì)煙草野火病、黑脛病的防治效果較好。但由于綠色木霉的生長(zhǎng)與繁殖受環(huán)境因素影響較大［21］，其單獨(dú)施用的效果并不穩(wěn)定，而高碳基肥料中的有機(jī)物料能夠?yàn)槲⑸锏纳L(zhǎng)繁殖提供可直接利用的養(yǎng)分［7,22］，其中生物炭的多孔結(jié)構(gòu)也可為微生物提供良好的棲息環(huán)境［23］。因此，微生物制劑配施生物炭有機(jī)肥的研究在煙草生產(chǎn)上具有重要意義。目前，生物炭及其有機(jī)肥在煙草上的研究多集中在植煙土壤保育方面，對(duì)綠色木霉在煙草上的研究多涉及病害生物防治，而對(duì)于兩者的配合施用研究較少。為此，通過(guò)田間試驗(yàn)研究了高碳基肥料配施綠色木霉對(duì)烤煙品質(zhì)的影響，旨在為生物炭有機(jī)肥配施微生物制劑在煙草生產(chǎn)上的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)基本情況

于2015 年在河南省許昌縣（北緯34°01′，東經(jīng)113°49′）河南農(nóng)業(yè)大學(xué)現(xiàn)代煙草農(nóng)業(yè)科技園進(jìn)行田間試驗(yàn)。該產(chǎn)區(qū)屬北暖溫帶季風(fēng)氣候，季節(jié)分明，年平均氣溫14.6 ℃，平均日照總時(shí)數(shù)2 282 h，年降雨量1 000～1 100 mm，無(wú)霜期220～240 d。

1.2 試驗(yàn)材料

供試土壤類(lèi)型為淋溶褐土，試驗(yàn)地為1 年休閑地，土壤肥力均勻。土壤理化性狀：有機(jī)質(zhì)13.47 g·kg-1，堿解氮132.47 mg·kg-1，速效磷10.11 mg·kg-1，速效鉀137.5 mg·kg-1，pH 7.77。供試烤煙品種為中煙100。高碳基肥料（河南惠農(nóng)土質(zhì)保育研發(fā)有限公司）是一種以生物炭為主要原料的有機(jī)肥，主要養(yǎng)分N≥2%，P2O5≥1%，K2O≥2%。其中：生物炭≥200 g·kg-1、有機(jī)質(zhì)為45%（有機(jī)質(zhì)來(lái)源為芝麻餅）；煙草專(zhuān)用復(fù)合肥（N≥10%，P2O5≥10%，K2O≥20%）；硫酸鉀（K2O≥50%）、重過(guò)磷酸鈣（P2O5≥44%）和過(guò)磷酸鈣（P2O5≥15%）。綠色木霉（Trichoderma viride）制劑為可濕性粉劑由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院提供，有效孢子數(shù)3×108個(gè)·g-1。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

設(shè)置4 個(gè)處理：常規(guī)施肥（CK）；施用綠色木霉制劑（T1）；施用高碳基肥料（T2）；高碳基肥料配施綠色木霉（T3）。每處理重復(fù)3 次，隨機(jī)區(qū)組排列，小區(qū)面積95 m2，行距1.2 m，株距0.5 m。煙苗于5 月12 日移栽，純氮用量45 kg·hm-2，各處理總施氮量相同，N∶P2O5∶K2O=1∶1.5∶3，肥料用量見(jiàn)表1。具體施肥方法：CK、T1、T2 處理按表1 中的肥料用量混勻后于移栽前1 d 條施；綠色木霉制劑單獨(dú)灌根施用，將綠色木霉制劑與水均勻混合，混合后水溶液質(zhì)量體積比為8.33 g·L-1，將混合液在煙苗移栽后1 周灌根施用，每株煙苗混合液用量為20 mL；綠色木霉制劑與高碳基肥料配施時(shí)，于起壟前1 周將綠色木霉制劑和高碳基肥料均勻混合后單獨(dú)條施，混合后肥料中綠色木霉制劑含量（質(zhì)量比）為0.2%，T3 處理的其他肥料于起壟前1 d 混勻，與高碳基肥料分行條施。其他栽培及田間管理措施按當(dāng)?shù)貎?yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)技術(shù)規(guī)范進(jìn)行。

表1 不同處理的肥料用量Tab.1 Amount of fertilizer and Trichoderma viride applied in different treatments （kg·hm-2）

1.3.2 取樣方法

煙株打頂后，自下而上第13 位葉片（去除底部1～2 片無(wú)效葉片）進(jìn)行掛牌標(biāo)記，烤煙成熟收獲后按處理及小區(qū)將烤后煙葉分開(kāi)，每小區(qū)取掛牌標(biāo)記的烤后煙葉2 kg，去除煙梗后置于ZZSY-2150型電熱鼓風(fēng)干燥箱（鄭州生元儀器有限公司）中在45 ℃條件下烘干至恒質(zhì)量，碾碎后過(guò)篩（篩網(wǎng)孔徑0.25 mm），保存，備用。

1.3.3 測(cè)定指標(biāo)與方法

按照YC/T 176—2003［24］方法測(cè)定烤后煙葉石油醚提取物含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）；按照YC/T 202—2006［25］方法測(cè)定綠原酸、蕓香苷和莨菪亭含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）并計(jì)算總量；參照周輝等［26］的方法測(cè)定非揮發(fā)性有機(jī)酸和高級(jí)脂肪酸含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）；采用內(nèi)標(biāo)法測(cè)定中性致香物質(zhì)含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)），以硝基苯為內(nèi)標(biāo)，儀器為HP 5890-5972 氣質(zhì)聯(lián)用儀（美國(guó)Agilent 公司），前處理及GC/MS 分析條件參照韋鳳杰等［27］的方法進(jìn)行，由GC/MS 鑒定結(jié)果和NIST庫(kù)檢索定性，結(jié)果為3次重復(fù)測(cè)定的平均值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2013 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，SPSS 22.0 軟件進(jìn)行方差分析，Duncan’s 新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對(duì)烤煙石油醚提取物及多酚類(lèi)物質(zhì)含量的影響

如表2 所示，T2 和T3 處理烤后中部葉石油醚提取物含量比對(duì)照（CK）分別顯著提高11.11%和27.51%，T1 處理與對(duì)照間差異不顯著。T3 處理中部葉石油醚提取物含量比T1 和T2 處理顯著提高，增幅分別達(dá)到20.30%和14.76%。

T3 處理中部葉綠原酸含量顯著高于對(duì)照，提高43.84%，而對(duì)照、T1 和T2 處理間的差異不顯著。T2 和T3 處理中部葉莨菪亭含量均顯著高于對(duì)照，增幅分別為41.38%和20.69%，而對(duì)照與T1處理間的差異不顯著。各處理中部葉蕓香苷含量以T3 處理最高，為9.98 mg·g-1，比對(duì)照提高79.17%，T2 處理亦顯著高于對(duì)照，T1 處理與對(duì)照間的差異不顯著。各處理中部葉多酚物質(zhì)總量與蕓香苷含量的變化規(guī)律基本一致，其中T3 處理比對(duì)照提高53.76%。

表2 不同處理對(duì)烤后中部葉石油醚提取物及多酚物質(zhì)含量的影響①Tab.2 Effects of different treatments on contents of petroleum extracts, chlorogenic acid, scopoletin, rutin and total polyphenols in cured middle leaves

2.2 不同處理對(duì)烤煙有機(jī)酸含量的影響

如表3 所示，T2 和T3 處理中部葉蘋(píng)果酸含量比對(duì)照分別顯著提高31.71%和10.92%，而T1 處理低于對(duì)照，且差異不顯著。T1、T2 和T3 處理中部葉檸檬酸含量均低于對(duì)照，其中T2 和T3 處理分別比對(duì)照降低10.63%和29.82%，T1 處理與對(duì)照差異不顯著。T3 處理中部葉草酸含量比對(duì)照降低19.46%，T1 處理與對(duì)照間差異不顯著。T3 處理中部葉棕櫚酸含量顯著高于其他處理，而其他處理間差異不顯著。T1、T2 和T3 處理中部葉油酸含量均低于對(duì)照，T3 處理比對(duì)照降低26.61%。各處理中部葉丙二酸、硬脂酸、亞油酸含量間差異均不顯著。

表3 不同處理對(duì)烤后中部葉有機(jī)酸含量的影響Tab.3 Effects of different treatments on organic acid contents in cured middle leaves （mg·g-1）

2.3 不同處理對(duì)烤煙中性致香物質(zhì)含量的影響

不同處理烤后中部葉中性致香物質(zhì)種類(lèi)和含量分析結(jié)果見(jiàn)表4。與對(duì)照和T1 處理相比，T2 和T3 處理中部葉28 種香氣物質(zhì)總量均有所提高。烤后煙葉中共檢測(cè)出18 種類(lèi)胡蘿卜素降解產(chǎn)物，T3 處理中部葉類(lèi)胡蘿卜素降解產(chǎn)物總量最高，比對(duì)照提高25.17%。β-大馬酮、β-二氫大馬酮、二氫獼猴桃內(nèi)酯、法尼基丙酮、巨豆三烯酮等致香物質(zhì)含量與對(duì)照相比有所提高。T2 處理中部葉類(lèi)胡蘿卜素降解產(chǎn)物總量顯著高于對(duì)照，增幅達(dá)到10.03%，T1 處理與對(duì)照間差異不顯著。

4 類(lèi)芳香族氨基酸裂解產(chǎn)物及其總量均以T3處理最高，芳香族氨基酸裂解產(chǎn)物總量比對(duì)照增加48.94%。T2 處理中部葉芳香族氨基酸裂解產(chǎn)物總量比對(duì)照提高28.45%，T1 處理與對(duì)照間差異不顯著。如表4 所示，T3 處理茄酮含量達(dá)到60.50μg·g-1，比對(duì)照、T1 和T2 處理分別增加46.88%、43.23%和13.64%，差異均達(dá)到顯著水平。T2 處理茄酮含量比對(duì)照顯著提高29.25%，而對(duì)照和T1 處理間茄酮含量差異不顯著。

各處理中部葉棕色化反應(yīng)產(chǎn)物總量以T3 處理最高，比對(duì)照顯著提高21.70%，主要表現(xiàn)為糠醛、5-甲基糠醛、β-環(huán)檸檬醛含量比對(duì)照有所提高。各處理的中部葉棕色化反應(yīng)產(chǎn)物中均以糠醛含量最高，T3 處理糠醛含量為17.02 μg·g-1，比對(duì)照和T2 處理分別提高18.61%和10.66%，T2 處理糠醛含量比對(duì)照增加7.18%，對(duì)照與T1 處理糖醛含量相近。T2 處理棕色化反應(yīng)產(chǎn)物總量比對(duì)照顯著提高11.95%，T1 處理與對(duì)照相比有所增加，但處理間差異不顯著。

表4 不同處理對(duì)烤后中部葉中性致香物質(zhì)的影響①Tab.4 Effects of different treatments on aroma components in cured middle leaves （μg·g-1）

表4（續(xù)）

T3 處理新植二烯含量比對(duì)照、T1 和T2 處理均有顯著提高，增幅分別為37.78%、37.38%和26.76%；T2 處理新植二烯含量比對(duì)照亦有顯著提高，而對(duì)照與T1 處理間差異不顯著。各處理除新植二烯外中性致香物質(zhì)總量均以T3 處理最高，顯著高于其他處理，比對(duì)照增加32.06%；T2 處理除新植二烯外中性致香物質(zhì)總量比對(duì)照提高16.66%。T3 處理中性致香物質(zhì)總量達(dá)到1 081.15μg·g-1，比對(duì)照、T1 和T2 處理均有顯著提高，增幅分別為36.77%、35.73%和24.22%；T2 處理中性致香物質(zhì)總量比對(duì)照增加10.11%，對(duì)照和T1 處理間中性致香物質(zhì)總量差異不顯著。

3 討論

3.1 高碳基肥料配施綠色木霉條件下烤煙中部葉石油醚提取物含量的變化

采用高碳基有機(jī)肥料與綠色木霉制劑配施比常規(guī)施肥烤煙中部初烤煙葉中的石油醚提取物含量顯著提高，可能與綠色木霉分泌的纖維素酶有關(guān)。其機(jī)制包括誘導(dǎo)煙草體內(nèi)茉莉酸的合成［28］，進(jìn)而提高烤煙葉片石油醚提取物及腺毛分泌物含量［29］，以及通過(guò)提高煙草細(xì)胞中3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A 還原酶（HMGR）與倍半萜烯環(huán)化酶的活性而促進(jìn)異戊二烯（IPP，萜類(lèi)代謝途徑起始物）前體物質(zhì)甲羥戊酸（MVA）的合成［30-31］。施用高碳基有機(jī)肥料處理的石油醚提取物含量比常規(guī)施肥顯著提高，說(shuō)明高碳基肥料的施用對(duì)提高煙葉石油醚提取物含量也有積極作用，這與劉典三等［32］的研究結(jié)果基本一致。有研究證實(shí)，適量施用鉀及微量元素均有利于煙葉石油醚提取物含量的提高［33-34］。在各處理氮素和鉀素施用量保持一致的條件下，施用高碳基肥料比常規(guī)施肥處理煙葉中石油醚提取物含量顯著提高，這可能與高碳基肥料能夠提高烤煙對(duì)鉀的吸收以及植煙土壤微量元素的有效性有關(guān)［35-36］。

3.2 高碳基肥料配施綠色木霉條件下烤煙中部葉多酚及有機(jī)酸含量的變化

本試驗(yàn)中施用高碳基肥料處理的中部初烤煙葉中莨菪亭、蕓香苷及3 種酚類(lèi)物質(zhì)總量顯著高于對(duì)照，這可能與高碳基肥料中的生物炭能提高植煙土壤中硝態(tài)氮含量且同時(shí)降低銨態(tài)氮含量有關(guān)［37］，室內(nèi)和田間試驗(yàn)均表明在高硝態(tài)氮環(huán)境中生長(zhǎng)的煙株比在高氨態(tài)氮環(huán)境中生長(zhǎng)的煙株多酚含量提高［38-39］。高碳基肥料配施綠色木霉處理的3 種酚類(lèi)物質(zhì)及其總量均顯著高于施用高碳基肥料的處理，這可能與綠色木霉生物肥料能通過(guò)增加土壤中銨氧化古菌（AOA）和銨氧化細(xì)菌（AOB）豐度來(lái)增強(qiáng)其硝化作用，進(jìn)而提高土壤中硝態(tài)氮含量有關(guān)［40］。除此之外，綠色木霉能提高煙草苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性［30］，而PAL 是煙草多酚合成代謝主要途徑——莽草酸途徑的關(guān)鍵酶之一［41］，這可能是本試驗(yàn)中采用配施處理的酚類(lèi)物質(zhì)及其總量均顯著高于單施高碳基肥料處理的原因之一。

本研究中施用高碳基肥料處理比對(duì)照煙葉中蘋(píng)果酸及非揮發(fā)性有機(jī)酸總量提高，而檸檬酸和草酸含量較低，這與許娜等［42］的研究結(jié)果基本一致。高碳基肥料配施綠色木霉處理的煙葉中蘋(píng)果酸、棕櫚酸及有機(jī)酸物質(zhì)總量高于其他3 個(gè)處理，而檸檬酸、草酸與亞油酸含量降低，這可能與綠色木霉施用能夠促進(jìn)植物對(duì)鉀的吸收［43］，提高烤煙對(duì)鉀肥的利用率有關(guān)［19］，有研究表明，鉀含量較高的煙葉亞油酸、檸檬酸含量較低，蘋(píng)果酸及非揮發(fā)性有機(jī)酸總量較高［44］。

3.3 高碳基肥料配施綠色木霉條件下烤煙中部葉中性致香物質(zhì)含量的變化

本試驗(yàn)中施用高碳基肥料比常規(guī)施肥烤煙中部葉胡蘿卜素類(lèi)降解產(chǎn)物總量及新植二烯含量顯著提高，這與高碳基肥料中的生物炭能夠提高烤煙葉片中類(lèi)胡蘿卜素和葉綠素含量有關(guān)［45］，但其作用機(jī)制尚不明確；國(guó)內(nèi)外研究均證實(shí)綠色木霉能提高植物葉片中類(lèi)胡蘿卜素和葉綠素含量［13,19,46］，也有研究表明，綠色木霉分泌的纖維素酶能使煙草葉片中揮發(fā)性新植二烯含量大幅提高［28］，而高碳基肥料配施綠色木霉比對(duì)照和施用高碳基肥料烤煙中部葉胡蘿卜素類(lèi)降解產(chǎn)物總量及新植二烯含量均顯著提高，可能與此有關(guān)。高碳基肥料配施綠色木霉與其他施肥措施相比烤煙中部葉中性致香物質(zhì)總量顯著提高，這表明該配施措施能夠提高煙葉香氣量。

本試驗(yàn)中單施綠色木霉對(duì)烤煙中部葉相關(guān)指標(biāo)無(wú)顯著影響，表明盡管在移栽后1 周施用綠色木霉，但條施的化肥可能仍在煙株根際周邊集中，進(jìn)而對(duì)綠色木霉的定殖或生長(zhǎng)繁殖產(chǎn)生抑制，這與前人研究結(jié)果基本一致［47］。本試驗(yàn)中配施措施與單施綠色木霉相比多項(xiàng)指標(biāo)均有顯著差異，表明采用配施措施后綠色木霉的有效性提高，也說(shuō)明該配施措施受化肥的影響小，綠色木霉的存活率提高，因此配施措施對(duì)烤煙香氣相關(guān)指標(biāo)的提高效果較為顯著。

4 結(jié)論

在河南許昌煙草農(nóng)業(yè)科技園，以中煙100 作為栽培品種的條件下：①采用高碳基肥料與綠色木霉配施的施肥措施能夠顯著提高烤后中部煙葉的香味前體物質(zhì)、潛香成分含量，如石油醚提取物、多酚類(lèi)物質(zhì)、有機(jī)酸等。②采用高碳基肥料與綠色木霉配合施用后，初烤中部葉多種中性致香成分明顯提高，如類(lèi)胡蘿卜素類(lèi)降解產(chǎn)物、棕色化反應(yīng)產(chǎn)物、新植二烯等。③施用高碳基肥料后烤后中部煙葉的石油醚提取物、多酚類(lèi)物質(zhì)及中性致香成分含量顯著提高。④采用常規(guī)施肥基礎(chǔ)上僅施用綠色木霉制劑對(duì)烤后中部葉致香成分相關(guān)指標(biāo)影響不顯著。