彭桂新，楊永鋒，胡靜宜，王寶林，劉向真，劉茂林，牛洋洋，方蔣平，姚旭博，陳紅麗*

1. 河南中煙工業(yè)有限責任公司技術中心，鄭州經(jīng)濟技術開發(fā)區(qū)第三大街8 號 450000

2. 河南農(nóng)業(yè)大學煙草學院，鄭州市金水區(qū)農(nóng)業(yè)路63 號 450002

3. 江蘇中煙工業(yè)有限責任公司技術中心，南京市建鄴區(qū)興隆大街29 號 210000

煙草是重要的經(jīng)濟作物，對生態(tài)環(huán)境條件的變化極為敏感［1-2］。生態(tài)因素、栽培因素和遺傳因素共同決定了煙葉質(zhì)量的形成。其中，生態(tài)因素決定了煙葉的香型風格特征［3］。由于中國煙葉種植區(qū)域生態(tài)環(huán)境的差異，我國煙葉形成了不同的香型風格［4］。煙葉香型是煙葉質(zhì)量和使用的重要依據(jù)和主要指標［5］。我國根據(jù)煙葉的香型特征，主要分3 個香型即濃香型、中間香型和清香型烤煙。其中，濃香型烤煙以河南煙區(qū)、湖南煙區(qū)為代表，中間香型煙葉以貴州煙區(qū)、黑龍江煙區(qū)為代表，清香型煙葉以云南煙區(qū)、四川煙區(qū)為代表［6-7］。有機酸廣泛存在于煙草中，是煙草生長發(fā)育過程中的三羧酸循環(huán)產(chǎn)物，煙葉中的有機酸主要以非揮發(fā)性有機酸的形式存在，對煙草的生理代謝起著重要的作用［8-13］。煙草中的非揮發(fā)性有機酸雖然不能直接作用于煙葉的風味，但能與煙葉中的生物堿結合生成鹽，從而調(diào)節(jié)游離煙堿的含量、使煙氣的酸堿度得到平衡、煙氣醇和，是影響煙草感官質(zhì)量的主要物質(zhì)之一［14-18］。已有研究表明，煙葉中的非揮發(fā)性有機酸主要影響煙葉感官質(zhì)量評價指標中的刺激性、濃度和勁頭［19-20］。

近年來，國內(nèi)通過因子分析、判別分析和模糊數(shù)學理論等方法對煙葉質(zhì)量與生態(tài)環(huán)境、煙葉產(chǎn)區(qū)關系的研究日益增多［21-23］。但是上述分析方法識別率低，不能很好地建立煙葉特征識別模型［24-26］。正交偏最小二乘判別（OPLS-DA 分析）可以用于確定不同類別分界面的最優(yōu)位置，能夠提高模型的預測效果，解釋造成模式之間差異的根本原因，而且降低了對樣本量的較高要求［27-29］。前人的研究多集中在不同香型單等級煙葉常規(guī)化學成分差異以及多酚類物質(zhì)差異的比較，但是常規(guī)化學成分在不同香型間存在較多交叉，多酚類物質(zhì)含量受海拔等因素影響較明顯，且實驗操作較復雜，檢測指標過多，檢測過程較繁瑣。能夠準確快捷、操作簡便地區(qū)分濃香型多等級混合配打模塊煙葉非揮發(fā)性有機酸含量的研究方法較少。

因此，以我國3 個香型8 個產(chǎn)區(qū)的33 個多等級配打模塊煙葉為研究對象，基于正交偏最小二乘法判別分析，探索不同香型模塊煙葉非揮發(fā)性有機酸含量的差異，并進行解釋和分析，以期為濃香型模塊煙葉風格定位和煙葉質(zhì)量評價分析提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

選取2019 年來源于不同產(chǎn)區(qū)、不同香型的33個多等級配打模塊煙葉樣品，其中清香型模塊9個，分別產(chǎn)自典型清香型產(chǎn)區(qū)四川、云南、福建3個省份；濃香型模塊17 個，分別產(chǎn)自典型濃香型產(chǎn)區(qū)湖南、河南2 個省份；中間香型模塊8 個，分別產(chǎn)自典型中間香型產(chǎn)區(qū)黑龍江、貴州、重慶3 個省份。所有樣品均為多等級混合打葉后的片煙，經(jīng)河南中煙工業(yè)有限責任公司技術中心收集后，統(tǒng)一復烤后制成。具體產(chǎn)地信息見表1。

濃硫酸、甲醇、二氯甲烷（AR，國藥集團化學試劑有限公司）；己二酸（內(nèi)標）、草酸、蘋果酸、檸檬酸、棕櫚酸甲酯、亞油酸甲酯、油酸甲酯、硬脂酸甲酯（色譜純，美國百靈威公司）。

Agilent 6890 型氣相色譜儀（美國Agilent 公司）。DHG-9145A 型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海一恒科技有限公司）。標準篩（浙江省上虞市五四儀器篩具廠）。

表1 33 份樣品的產(chǎn)地信息Tab.1 Producing area information of 33 samples

1.2 方法

1.2.1 樣品處理

樣品置于40 ℃烘箱2 h。烘干后混合均勻，用四分法取一部分樣品磨成粉末過60 目（孔徑：250 μm）篩，進行非揮發(fā)性有機酸的測定。

1.2.2 非揮發(fā)性有機酸含量的測定

非揮發(fā)性有機酸含量按照文獻［18］的方法采用氣相色譜法進行測定。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

1.2.3.1 描述統(tǒng)計和差異顯著性分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析使用DPS7.05 軟件。各成分所對應的字母代號分別為：草酸（X1）、丙二酸（X2）、α-戊酮酸（X3）、富馬酸（X4）、丁二酸（X5）、蘋果酸（X6）、2,4-庚二烯酸（X7）、檸檬酸（X8）、十六酸（X9）、亞油酸（X10）、油酸（X11）、十八酸（X12）、非揮發(fā)性有機酸總量（X13）。

1.2.3.2 正交偏最小二乘法判別分析

正交偏最小二乘法判別分析是基于變量X 構建變量Y 的預測模型。本試驗中，非揮發(fā)性有機酸各指標為變量X，煙葉的不同香型為變量Y。使用SIMCA-P14.1 軟件對分類后的樣品非揮發(fā)性有機酸含量進行OPLS-DA 分析。

2 結果與討論

2.1 煙葉非揮發(fā)性有機酸的統(tǒng)計描述

煙葉非揮發(fā)性有機酸的描述統(tǒng)計見表2。由表2 可以看出，α-戊酮酸（X3）、2,4-庚二烯酸（X7）、檸檬酸（X8）的偏度稍大，其余指標的偏度均較小，基本符合正態(tài)分布特征。α-戊酮酸、2,4-庚二烯酸和檸檬酸向右偏離中心稍遠（偏度值＞1）。按照變異系數(shù)劃分等級，丁二酸（X5）為弱變異性（變異系數(shù)≤10%），其余各指標均為中等變異性（變異系數(shù)在10%～100%）。

表2 煙葉非揮發(fā)性有機酸的描述性統(tǒng)計分析Tab.2 Descriptive statistical analysis of non-volatile organic acids in tobacco leaves

2.2 不同香型配打模塊煙葉非揮發(fā)性有機酸含量差異顯著性分析

對3 個香型配打模塊煙葉非揮發(fā)性有機酸的13 個指標進行統(tǒng)計分析，結果見表3。由表3 可以看出，①草酸（X1）含量在不同香型配打模塊煙葉間存在顯著差異，清香型模塊煙葉草酸含量顯著低于濃香型模塊和中間香型模塊煙葉。②丁二酸（X5）含量在不同香型模塊煙葉間存在極顯著差異，中間香型模塊煙葉丁二酸含量顯著低于清香型模塊和濃香型模塊煙葉。③丙二酸（X2）、蘋果酸（X6）、檸檬酸（X8）和亞油酸（X10）含量在不同香型模塊煙葉間存在極顯著差異，濃香型模塊煙葉丙二酸、蘋果酸、檸檬酸和亞油酸含量顯著高于清香型模塊和中間香型模塊煙葉。④α-戊酮酸（X3）、富馬酸（X4）、2,4-庚二烯酸（X7）、十六酸（X9）、油酸（X11）和十八酸（X12）的含量在不同香型模塊煙葉間無顯著性差異。非揮發(fā)性有機酸總量（X13）以濃香型模塊煙葉最高，且與清香型模塊和中間香型模塊煙葉的差異達到極顯著水平。綜上所述，3 個香型配打模塊煙葉在多個非揮發(fā)性有機酸指標上存在顯著差異，這種差異可以用來區(qū)分配打模塊煙葉風格特征。

表3 不同香型模塊煙葉非揮發(fā)性有機酸含量差異顯著性分析①Tab.3 Significant difference analysis of non-volatile organic acid content in tobacco leaves in modules with different flavor styles

2.3 不同香型配打模塊煙葉非揮發(fā)性有機酸OPLS-DA 模型

對不同香型模塊的煙葉樣品非揮發(fā)性有機酸含量建立OPLS-DA 模型，篩選出了2 個預測主成分和3 個正交主成分。其中，R2X=0.77，表示5 個主成分對X 變量變異的解釋能力為77%；R2Y=0.774，表示2 個預測主成分對Y 變量變異的解釋能力為77.4%；Q2=0.627，表示2 個預測主成分對不同香型配打模塊煙葉樣品的預測能力為62.7%。一般來說，R2和Q2＞0.5 時，該模型的預測能力較好且模型較穩(wěn)定。采用置換檢驗對模型的可靠性進行了驗證，結果見圖1。通過驗證圖可以看出，位于左側的置換檢驗隨機模型的Q2值均小于位于右側原模型的Q2值，模型結果參數(shù)Q2的回歸線與縱軸的截距為-0.474，小于0，表明模型較可靠，不存在過擬合現(xiàn)象。總的來說，模型的模擬效果較好。

圖1 OPLS-DA 模型置換檢驗示意圖Fig.1 Schematic diagram of permutation test of OPLS-DA model

圖2 為基于非揮發(fā)性有機酸12 個指標的3 個香型配打模塊煙葉33 個樣品OPLS-DA 模型第1、2主成分得分圖。由圖2 可以看出，不同香型配打模塊煙葉有明顯聚集的趨勢，不同香型配打模塊煙葉可明顯區(qū)分開來，其中橫坐標為第一主成分得分，表明通過第一主成分可將濃香型模塊煙葉同清香型模塊和中間香型模塊煙葉區(qū)分開；縱坐標為第二主成分得分，表明通過第二主成分可將清香型模塊和中間香型模塊煙葉區(qū)分開。本試驗中，構建的OPLS-DA 模型能夠較好地將3 個香型模塊煙葉區(qū)分開，模型的模擬效果較好。

圖2 OPLS-DA 模型得分圖Fig.2 Score of OPLS-DA model

2.4 不同香型配打模塊煙葉非揮發(fā)性有機酸分類指標篩選

圖3 為OPLS-DA 模型中非揮發(fā)性有機酸各指標 的VIP（Variable Importance for the Projection）圖。VIP 值越大，說明與香型差異的相關性越高，對解釋變量的貢獻率越大。圖4 為OPLS-DA 模型第一主成分、第二主成分載荷圖，表示了兩個主成分非揮發(fā)性有機酸指標和不同香型配打模塊煙葉的相關性，圖中非揮發(fā)性有機酸指標與香型的距離越小，說明該指標對這個香型的相關性越高，影響越大。

圖3 OPLS-DA 模型VIP 值Fig.3 VIP values of OPLS-DA model

圖4 OPLS-DA 模型主成分載荷圖Fig.4 Principal component load diagram of OPLS-DA model

由圖3 可以看出，有6 個非揮發(fā)性有機酸指標對變量解釋的貢獻率較大（VIP＞1），按照貢獻率由大到小的順序排列分別為丁二酸（X5）、檸檬酸（X8）、蘋果酸（X6）、丙二酸（X2）、亞油酸（X10）和草酸（X1）。由圖4 可以看出，6 個對解釋變量貢獻率較大的指標丁二酸、檸檬酸、蘋果酸、丙二酸、亞油酸和草酸均與濃香型較靠近，與清香型和中間香型相對較遠，說明丁二酸、檸檬酸、蘋果酸、丙二酸、亞油酸和草酸6 個指標與濃香型模塊煙葉的相關性較高，與清香型模塊和中間香型模塊煙葉相關性相對較低，非揮發(fā)性有機酸對濃香型模塊煙葉的影響高于清香型模塊和中間香型模塊煙葉。因此，非揮發(fā)性有機酸可作為濃香型模塊煙葉區(qū)別于清香型模塊和中間香型模塊煙葉的主要化學成分。按照6 個指標與濃香型模塊煙葉的距離由小到大排列，檸檬酸與濃香型距離最小，說明檸檬酸對濃香型模塊煙葉的相關性最高，其次是丙二酸、蘋果酸，6 個對解釋變量貢獻較大的指標中，草酸與濃香型模塊煙葉的相關性相對較小。由表3 可以看出，經(jīng)過OPLS-DA 模型篩選出來的與濃香型相關性較高的6 個指標在不同香型間均存在顯著性差異，具有統(tǒng)計學意義，可以作為濃香型特征非揮發(fā)性有機酸指標。

3 結論

（1）不同香型模塊烤煙非揮發(fā)性有機酸含量存在顯著性差異。其中，濃香型模塊煙葉草酸含量顯著高于清香型模塊煙葉；濃香型模塊煙葉丙二酸、蘋果酸、檸檬酸和亞油酸的含量高于清香型模塊和中間香型模塊煙葉；濃香型模塊煙葉丁二酸含量顯著高于中間香型模塊煙葉；濃香型模塊煙葉非揮發(fā)性有機酸總量顯著高于清香型模塊和中間香型模塊煙葉。

（2）基于非揮發(fā)性有機酸建立的OPLS-DA 模型模擬效果較好，模型參數(shù)R2X、R2Y 和Q2分別為0.770、0.774 和0.627。

（3）通過模型得到的2 個主成分得分可較好地區(qū)分不同香型配打模塊的煙葉。通過第一主成分可將濃香型模塊煙葉同清香型模塊和中間香型模塊煙葉區(qū)分開；通過第二主成分可將清香型模塊和中間香型模塊煙葉區(qū)分開。

（4）通過模型篩選出VIP 值大于1 的6 個非揮發(fā)性有機酸指標（丁二酸、檸檬酸、蘋果酸、丙二酸、亞油酸、草酸）與濃香型模塊煙葉的相關性較大，6 個指標可作為濃香型模塊煙葉的特征指標；影響濃香型模塊煙葉的最主要指標依次為檸檬酸、丙二酸、蘋果酸、亞油酸、丁二酸和草酸。