王鑫磊，袁湘汝，張瀟瀟，解茹越，肖衛(wèi)華，韓魯佳

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)工學(xué)院，北京100083）

0 引 言

氮作為生命元素之一，廣泛存在于自然界中，在物質(zhì)代謝與能量轉(zhuǎn)化過程中有著不可替代的作用。在大氣污染[1–2]、溫室氣體[3]、水體富營養(yǎng)、土壤肥力[4–5]、植物生長[6]、食品營養(yǎng)[7]、飼料蛋白[8]等領(lǐng)域，氮均扮演著十分重要的角色[9]。

環(huán)境污染、資源短缺的今天，資源儲量巨大、可再生的生物質(zhì)資源已引起人們的廣泛關(guān)注。農(nóng)作物秸稈等農(nóng)業(yè)生物質(zhì)因富含氮、碳、磷、鉀等營養(yǎng)元素，眾多學(xué)者對其不同的基礎(chǔ)特性[10-12]及其飼料化、肥料化、能源化等利用技術(shù)[13-16]進行了深入的探索與研究。其中，物料總氮的含量是指導(dǎo)農(nóng)作物秸稈等農(nóng)業(yè)生物質(zhì)科學(xué)利用的重要參數(shù)。

目前，氮含量測定最為普遍的方法為凱氏定氮法和杜馬斯燃燒法。凱氏定氮法的工作原理是利用濃硫酸消解樣品，將氮素轉(zhuǎn)換為NH4+，后通過酸堿滴定測定NH4+含量，并據(jù)此推算出樣品氮含量，對樣品均勻性要求小[9]，在醫(yī)學(xué)、植物學(xué)、食品等學(xué)科中應(yīng)用普遍。杜馬斯燃燒法的工作原理是將樣品在900～1 200℃下燃燒后，通過將混合氣體中氮氧化物還原為氮氣，測定含量并計算氮素含量，具有檢測速度快、環(huán)境污染少、檢測誤差小等特點[17-21]，現(xiàn)已成為國際通用的檢測手段[18]。由于測試原理的不同，凱氏定氮法與杜馬斯燃燒法的測定結(jié)果存在顯著差異。針對蔬菜葉[20]、油料[22]、乳制品[23]、豆制品[24]、鮮花[25]、谷物[26]、肉制品[27]等不同物料的研究結(jié)果顯示，2種方法所得出的氮含量普遍存在線性相關(guān)關(guān)系。但是由于被測物料特性不同，這種線性相關(guān)關(guān)系也存在明顯的差別。

因此，本研究以產(chǎn)出量巨大、分布十分廣泛的水稻、小麥、玉米、棉花和油菜秸稈為研究對象，分別采用凱氏定氮法與杜馬斯燃燒法測定不同農(nóng)作物秸稈總氮含量，分析其含量變化及其數(shù)值分布，并深入比較上述不同測定方法所得氮含量的異同及其相關(guān)關(guān)系。以期為農(nóng)作物秸稈科學(xué)利用提供數(shù)據(jù)及方法互通性支撐。

1 材料與方法

1.1 樣本及制備

在中國大陸地區(qū)11個省級行政區(qū)（北京、天津、河北、山東、山西、陜西、甘肅、寧夏、青海、西藏和新疆）獲取代表性農(nóng)作物秸稈樣本共1 179個，其中水稻秸稈134個、小麥秸稈526個、玉米秸稈342個、油菜秸稈72個、棉花秸稈105個，去除谷物與根，僅保留秸稈中間的部分，樣本采集數(shù)量的區(qū)域分布如圖1所示。每個樣本的收到基質(zhì)量不少于2 kg。將收集到的樣本切短后置于烘箱中在45℃的條件下烘干36～48 h，然后用粉碎機粉碎至粒徑1 mm，過1 mm篩后封存作為干基樣本備用。

圖1 農(nóng)作物秸稈樣本采集數(shù)量區(qū)域分布圖Fig.1 Distributions of sample collection quantity for different crop residues

1.2 農(nóng)作物秸稈氮含量的測定

1.2.1 凱氏定氮法

采用AOAC方法[28]。測定時，稱量5 g左右樣本，加入7.8 g混合催化劑（7 g K2SO4和0.8 g CuSO4·5H2O），并加入12 mL濃硫酸，在200℃下消化1 h后升溫到420℃消化至溶液澄清。凱氏定氮儀（FOSS 2300）設(shè)定參數(shù)為：水70 mL、40%氫氧化鈉60 mL、1%硼酸30 mL。凱氏定氮法測定的氮含量記為TKN。

1.2.2 杜馬斯燃燒法

采用AOAC方法[29]。稱量約40 mg樣品并用錫箔包被，設(shè)定元素分析儀（Elementar,vario MACRO）參數(shù)為：燃燒管1 150℃、還原管850℃、通氧速率100 mL/min、通氧時間90 s、吹掃氣（He）速率500 mL/min，并進行自動檢測。杜馬斯燃燒法測定的氮含量記為TCN。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

線性擬合可以分析2參數(shù)之間的相關(guān)關(guān)系。普通最小 二 乘 （OLS） 和正交回歸 （ordinary least square，Orth）線性擬合采用Minitab軟件（版本：19.1）進行分析，最小中位數(shù)二乘（least median of square regression，LMS）線性擬合采用MASS程序包（版本：7.3-51.4，R版本：3.6.1）進行分析。OLS擬合方法僅假設(shè)因變量y存在誤差，由于本研究中作為自變量x的TCN同樣存在誤差，因此同時采用Orth方法對TKN與TCN的相關(guān)關(guān)系進行擬合。此外，OLS擬合方法適用于數(shù)據(jù)不存在異常值點的情況下。數(shù)據(jù)中異常值點的存在會干擾OLS的擬合結(jié)果，使得結(jié)果難以反映擬合關(guān)系的真實信息，因此采用LMS方法進行對比。研究通過AOAC方法中凱氏定氮法與杜馬斯燃燒法給出的RSDr計算得出正交回歸中誤差方差比（EDR）。

式中mean(RSDr,TKN)表示凱氏定氮法所給出實驗室內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)偏差RSDr的均值，mean(RSDr,TCN)表示杜馬斯燃燒法所給出RSDr的值。

數(shù)據(jù)分布分析及圖片繪制采用Origin軟件（版本：95C），其中分布分析使用常見的Normal、Lognormal、Gamma、Weibull、Exponential、Laplace 和 Lorentz 分 布進行對比。利用psych程序包（版本：1.8.12，R版本：3.6.1）進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。利用SPSS（版本：23.0）軟件對數(shù)據(jù)進行兩兩比較和多重比較，兩兩比較方法采用Student’s t檢驗多重比較方法采用Game-Howell檢驗，以適應(yīng)樣品總量不相等且方差非齊次的多重比較[11]，同時采用Mann-Whitney U檢驗和Kruskal–Wallis檢驗進行非參數(shù)兩兩比較和多重比較。地圖底板按照2012年中國政區(qū)圖繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同農(nóng)作物秸稈氮含量及其分布

2.1.1 數(shù)據(jù)分布

不同農(nóng)作物秸稈TKN及TCN數(shù)據(jù)分布如圖2、圖3所示。圖2結(jié)果表明，5種農(nóng)作物秸稈TKN含量均不呈正態(tài)分布，其中水稻秸稈、油菜秸稈和棉花秸稈近似服從Lognormal分布，而小麥秸稈和玉米秸稈近似服從Gamma分布。圖3結(jié)果表明，5種農(nóng)作物秸稈TCN含量同樣均不呈正態(tài)分布，其中水稻秸稈和油菜秸稈近似服從Lognormal分布，小麥秸稈近似服從Gamma分布，玉米秸稈和棉花秸稈近似服從Weibull分布。5種農(nóng)作物秸稈的TKN和TCN總體均近似服從Lognormal分布。對比圖2和圖3可以發(fā)現(xiàn)，水稻秸稈、小麥秸稈、油菜秸稈和秸稈總體的TKN和TCN含量的分布相同，而玉米秸稈和棉花秸稈的TKN和TCN含量分布存在差異。因此，在分析不同農(nóng)作物秸稈TKN和TCN的差異及關(guān)系的同時，也應(yīng)考慮到數(shù)據(jù)非正態(tài)分布對分析結(jié)果的影響。

圖2 不同農(nóng)作物秸稈凱氏氮分布直方圖Fig.2 Histograms of TKN distribution in different crop residues

圖3 不同農(nóng)作物秸稈燃燒氮分布直方圖Fig.3 Histograms of TCN distribution in different crop residues

2.1.2 統(tǒng)計分析

不同農(nóng)作物秸稈TKN和TCN含量的統(tǒng)計結(jié)果如表1所示，氮含量的箱型分布如圖4所示。由表1可見，5種農(nóng)作物秸稈的TKN均值在5.82～10.43 g/kg之間，TCN均值在6.39～11.64 g/kg之間。除水稻秸稈外，各種農(nóng)作物秸稈的TKN和TCN均存在顯著差異（P＜0.05）。其中，TKN整體分布低于TCN（圖4），可能是常規(guī)的凱氏定氮法難以將雜環(huán)化合物中的有機氮，以及N–N和N–O鍵中的氮元素進行還原，例如核酸、硝態(tài)氮與亞硝態(tài)氮[30–31]；而杜馬斯燃燒法因在高溫條件下可將所有氮素轉(zhuǎn)化為氮氧化物，進而轉(zhuǎn)化為氮氣進行檢測[32–33]，不僅可以檢測到樣本中有機態(tài)氮和銨態(tài)氮，而且也可以檢測出硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮[21]。

表1 五種典型農(nóng)作物秸稈凱氏氮與燃燒氮含量及其比較Table 1 Content and comparison of TKN and TCN in five typical crop residues

此外，部分種類秸稈間的氮含量也存在顯著的差異（P＜0.05）。就TKN而言，小麥秸稈的氮含量最低，水稻秸稈與油菜秸稈、玉米秸稈的氮含量差異不顯著，棉花秸稈的氮含量最高，不同的秸稈中氮含量由小到大排列依次為小麥秸稈＜油菜秸稈＜水稻秸稈＜玉米秸稈＜棉花秸稈；而就TCN而言，氮含量由小到大依次為小麥秸稈＜水稻秸稈＜油菜秸稈＜玉米秸稈＜棉花秸稈，油菜秸稈的氮含量顯著高于水稻秸稈，這與TKN的結(jié)果不同。與之前的研究對比，凱氏定氮法與杜馬斯燃燒法對秸稈氮元素的測定結(jié)果與Chen等[34]和Niu等[10]的研究結(jié)果相似。

中位數(shù)統(tǒng)計結(jié)果與均值統(tǒng)計的顯著性結(jié)果相同，但是由于農(nóng)作物秸稈的TKN與TCN含量數(shù)據(jù)不服從正態(tài)分布，因此中位數(shù)與均值存在差值（表1，圖4）。此外，中位數(shù)統(tǒng)計結(jié)果顯示不同秸稈的TKN與TCN含量排序相同，與TKN均值排列結(jié)果相同。與均值相比，在非正態(tài)分布下中位數(shù)統(tǒng)計結(jié)果受到極端值影響較少，建議采用中位數(shù)形式對農(nóng)作物秸稈的TKN與TCN含量進行統(tǒng)計分析。

圖4 不同農(nóng)作物秸稈凱氏氮與燃燒氮箱型圖Fig.4 Box plots of TKN and TCN in different crop residues

2.2 不同農(nóng)作物秸稈TKN與TCN的相關(guān)關(guān)系及比較分析

TKN與TCN的相關(guān)關(guān)系分別采用OLS、LMS和Orth方法對2參數(shù)進行分析，線性擬合結(jié)果如表2、圖5所示，其中Orth的EDR為3.70?？梢钥闯?，不同農(nóng)作物秸稈TKN與TCN含量存在良好的線性相關(guān)關(guān)系，但不同農(nóng)作物秸稈TKN與TCN含量的回歸方程擬合結(jié)果存在差異（斜率和截距均不同）。5種農(nóng)作物秸稈的OLS回歸方程斜率介于0.72～0.91之間，Orth回歸方程斜率均高于對應(yīng)OLS斜率，取值在0.77～0.96之間。除水稻秸稈與棉花秸稈外，各種農(nóng)作物秸稈的LMS斜率均高于OLS和Orth，取值在0.79～0.98之間。這3種方法所得的R2相等，擬合效果相同。但觀察圖5可以發(fā)現(xiàn)，相比于OLS和Orth，LMS所得結(jié)果穿越了樣本點密度更高的區(qū)域，而OLS則向相對樣本點相對稀疏的地方偏移，Orth介于二者之間。樣本密度越高，表明測量結(jié)果分布在該區(qū)域的概率越高，而穿過這些區(qū)域的擬合結(jié)果受到異常點的影響越小。因此建議采用LMS方法對TKN和TCN進行相關(guān)關(guān)系分析。

表2 農(nóng)作物秸稈凱氏氮和燃燒氮含量線性擬合結(jié)果Table 2 Linear fitting results of TKN and TCN contents in crop residues

圖5 農(nóng)作物秸稈TKN和TCN線性擬合結(jié)果核密度–散點圖Fig.5 Kernel density-scatter plots of linear fitting results for TKN and TCN in crop residues

2.3 不同物質(zhì)的TKN與TCN的相關(guān)關(guān)系及比較分析

本研究結(jié)果與已有文獻研究結(jié)果的比較如表3所示。由于大部分研究結(jié)果均采用OLS方法進行回歸擬合，因此本研究依然基于OLS的擬合結(jié)果進行分析討論。由表3可以看出，針對不同被測物料，TKN與TCN線性回歸方程的斜率處于0.37～1.74之間，差異較大。大部分植物類的原料其線性擬合的斜率在0.68～0.94之間，本文的研究與之相似。相對其它類的生物質(zhì)，植物類的生物質(zhì)擬合斜率較低，可能是植物樣本中硝態(tài)氮的含量較高，當(dāng)高于0.70%時，TKN測得的結(jié)果與TCN有較為明顯的差距[35–36]，而施用硝酸根為氮素的肥料會使得蔬菜等作物中含有較高的硝態(tài)氮[19]。此外葉片中的TKN與TCN含量線性回歸方程的斜率在0.68～0.86之間，其TCN的含量相對于TKN來說較高，可能是葉片中含有較多的葉綠素等物質(zhì)，含有較多的雜環(huán)態(tài)氮及硝態(tài)氮。畜禽糞便等生物質(zhì)的TKN與TCN含量斜率與蔬果等植物類含量相比較高[37]，可能是由于其硝酸鹽含量多數(shù)低于0.40%[21]，TKN與TCN測得的結(jié)果差距不明顯。物料中含量過低，接近儀器的檢出限，會導(dǎo)致斜率遠大于1.00，如酸性洗滌纖維[21]。如前所述，常規(guī)的凱氏定氮法可以檢測樣本中的有機態(tài)氮和銨態(tài)氮，而硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮則無法檢測出來[6–9,36–38]。這可能是由于凱氏定氮法在反應(yīng)過程中無法將硝態(tài)氮完全轉(zhuǎn)化為銨態(tài)氮檢測，而一部分由于硝酸鹽由于轉(zhuǎn)化為硝酸，而且自由碳原子會將硝酸根還原為氮氣[39]，在凱氏定氮法的反應(yīng)溫度下汽化、分解或轉(zhuǎn)化為氮氣揮發(fā)出去而無法測量[19]。另有部分學(xué)者認為僅硝酸鹽還無法完全解釋TKN與TCN含量的差異，核酸氮也可能有所不同[20]。此外，高分子化合物阻礙凱氏定氮法流程中的酸堿滴定也是可能致使TKN含量低的原因[40]。不同的物料中氮素的形態(tài)、含量各不相同[41]，也會直接導(dǎo)致TKN與TCN線性回歸方程斜率和截距也有較大的差距。

表3 不同物料凱氏氮與燃燒氮含量的線性回歸擬合結(jié)果及比較Table 3 Linear regression results and comparison of total nitrogen content values determined by Kjeldahl method and combustion method(TKN and TCN)in different materials

3 結(jié) 論

本研究所采集的農(nóng)作物秸稈樣本，其凱氏氮TKN與燃燒氮TCN含量分布范圍較廣，5種農(nóng)作物秸稈的TKN與TCN含量均呈非正態(tài)分布。研究結(jié)果顯示，除水稻秸稈外，農(nóng)作物秸稈的TCN分析結(jié)果顯著大于TKN（P＜0.05）；小麥秸稈和棉花秸稈與其它秸稈的總氮含量（TKN與TCN）存在顯著差異（P＜0.05）。

采用“中位數(shù)±絕對中位差”統(tǒng)計的TKN質(zhì)量分數(shù)由低到高依次為：小麥秸稈（5.66±1.07 g/kg）、油菜秸稈（7.10±1.87 g/kg）、水稻秸稈（8.20±1.42 g/kg）、玉米秸稈（8.82±2.23 g/kg）、棉花秸稈（10.42±1.45 g/kg）；TCN質(zhì)量分數(shù)由低到高依次為：小麥秸稈（6.17±1.17 g/kg）、油菜秸稈（8.50±2.45 g/kg）、水稻秸稈（8.59±1.45 g/kg）、玉米秸稈（10.10±1.91g/kg）、棉花秸稈（11.75±1.48g/kg）。

農(nóng)作物秸稈TKN與TCN間存在顯著的線性相關(guān)關(guān)系且不同農(nóng)作物秸稈的回歸方程不同，建議采用LMS方法進行線性相關(guān)關(guān)系的擬合。此外，不同種類生物質(zhì)TKN與TCN的相關(guān)關(guān)系存在差異。

致 謝

本研究得到現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（奶牛）產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項資金（CARS– 36）、國家重點研發(fā)計劃（2016YFE0112800）和公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項資金（201003063）的資助。感謝西北農(nóng)林科技大學(xué)郭康權(quán)教授在公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項資金（201003063）項目支持下提供的樣本和分析測定數(shù)據(jù)。