楊凌君，蘇銀燕，趙奕敏，王琤韡

（江西科技師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，南昌 330013）

藜蒿，又名艾蒿、蔞蒿、蘆蒿等，為菊科屬多年生草本植物，以根莖和嫩莖供食用，營(yíng)養(yǎng)豐富，可涼拌或炒食，作為鄱陽(yáng)湖一種特色時(shí)令蔬菜，深受大家喜歡。研究表明，被丟棄的藜蒿葉和老莖中含有豐富的黃酮類(lèi)化合物和活性多糖等天然活性成分，具有抗炎、抗菌、抗腫瘤、抗突變、抗衰老等廣泛的藥理作用[1-3]。黃酮類(lèi)化合物的提取方法主要有熱水浸提、醇法提取、微波輔助提取以及超聲輔助提取等[4]。由于醇法提取具有過(guò)程簡(jiǎn)單，研究成本低，利用率高等優(yōu)點(diǎn)，因此本實(shí)驗(yàn)選取醇法提取鄱陽(yáng)湖野生藜蒿葉中的黃酮類(lèi)化合物，通過(guò)實(shí)驗(yàn)找出黃酮類(lèi)化合物醇法提取的最佳工藝條件，為藜蒿葉中黃酮類(lèi)化合物的高效提取提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑、儀器

野生藜蒿葉采摘自鄱陽(yáng)湖，經(jīng)挑選、分類(lèi)、洗凈瀝干，低溫烘干至恒重，超微粉碎后過(guò)80目篩；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)買(mǎi)于合肥博美生物科技有限責(zé)任公司。

無(wú)水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、蒸餾水等所有試劑均為分析純，購(gòu)買(mǎi)于西隴科學(xué)股份有限公司。

電子天平（ES2000），天津市德安特傳感技術(shù)有限公司；電熱鼓風(fēng)恒溫干燥箱（DHG-9015A），上海一恒科學(xué)儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋（DK-S26），上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；722N可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海佑科儀器儀表有限公司；回流裝置。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 黃酮標(biāo)準(zhǔn)液的制備

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液（準(zhǔn)確稱(chēng)取0.010g蘆丁置于50mL容量瓶中，以60%乙醇溶解定容，取25mL定容后的溶液用蒸餾水稀釋至50mL，即蘆丁濃度為0.1mg/mL）。制備過(guò)程：準(zhǔn)備7 支有編號(hào)標(biāo)簽的25mL的試管（0、1、2、3、4、5、6號(hào)），準(zhǔn)確量取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0、1、2、3、4、5、6mL分別加入試管中，向每支試管中加入30%乙醇溶液5mL、5%亞硝酸鈉溶液0.3mL，搖勻，放置6min后再加入10%硝酸鋁溶液0.3mL，搖勻，放置6min，最后加入4%氫氧化鈉溶液4mL，用蒸餾水稀釋至25mL，放置25min 后在紫外分光光度計(jì)上設(shè)定波長(zhǎng)510nm 處測(cè)定各試管中溶液的吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，溶液濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。蘆丁濃度與吸光度呈線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r=0.9982，線性回歸方程y=0.011x+0.0027，滿足測(cè)定要求。

1.2.2 藜蒿葉總黃酮的制備

將新鮮摘的藜蒿取葉洗凈在鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)60℃下烘干至恒重，超微粉碎后過(guò)80目篩得到樣品粉末。準(zhǔn)確稱(chēng)取經(jīng)處理后的藜蒿葉樣品粉末1.000g 置于25mL 圓底燒瓶中，加入一定體積的70%乙醇溶液浸泡1h后，放入一定溫度恒溫水浴鍋中回流提取一定時(shí)間后，得到的提取液用濾紙過(guò)濾定容至25mL 作為樣品液備用。制備過(guò)程：準(zhǔn)備1支25mL的試管，準(zhǔn)確量取樣品液1mL加入試管中，向試管中加入30%乙醇溶液5mL、5%亞硝酸鈉溶液0.3mL，搖勻，放置6min后再加入10%硝酸鋁溶液0.3mL，搖勻，放置6min，最后加入4%氫氧化鈉溶液4mL，用蒸餾水稀釋至25mL，放置25min后在紫外分光光度計(jì)上設(shè)定波長(zhǎng)510nm處測(cè)定試管中溶液的吸光度。利用線性回歸方程計(jì)算藜蒿葉中總黃酮得提取率（其中每組實(shí)驗(yàn)均做3 組重復(fù)，下列表中總黃酮得率所代表的數(shù)值為3個(gè)重復(fù)組的平均數(shù)）。計(jì)算公式：

m1=xV×稀釋倍數(shù)

藜蒿葉總黃酮提取率=m1/m2×100%

式中，y 為吸光度；x 為濃度；m1為黃酮的質(zhì)量；m2為藜蒿葉樣品粉末的質(zhì)量；V為最初定容的體積。

1.2.3 藜蒿葉總黃酮提取率的影響

1.2.3.1 單因素對(duì)藜蒿葉總黃酮提取率的影響

單因素實(shí)驗(yàn)中以藜蒿葉粉末質(zhì)量（1g）不變的情況下，設(shè)置各元素之間變量與不變量的關(guān)系，進(jìn)行研究分析不同變量對(duì)藜蒿葉總黃酮提取率的影響。設(shè)提取溫度70℃、提取時(shí)間1.5h為不變量，研究分析不同液固比（5、10、15、20、25mL/g）對(duì)藜蒿葉總黃酮提取率的影響；設(shè)液固比20mL/g、提取時(shí)間1.5h為不變量，研究分析不同提取溫度（40、50、60、70、80℃）對(duì)藜蒿葉總黃酮提取率的影響；設(shè)液固比20mL/g、提取溫度70℃為不變量，研究分析不同提取時(shí)間（0.5、1、1.5、2、2.5h）對(duì)藜蒿葉總黃酮提取率的影響。

1.2.3.2 藜蒿葉總黃酮提取工藝正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

以液固比、提取溫度、提取時(shí)間3個(gè)選項(xiàng)進(jìn)行L9（33）正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果選定3個(gè)不同提取水平進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)見(jiàn)表1）。通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)確定藜蒿葉總黃酮提取的最佳工藝組合。

表1 提取藜蒿葉總黃酮的正交實(shí)驗(yàn)

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用Excel 2010 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)輸入，用Spss18.0軟件處理數(shù)據(jù)并進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

不同因素及不同提取水平下藜蒿葉中總黃酮提取率見(jiàn)表2。由表2 可知總黃酮提取率隨著液固比、提取溫度和提取時(shí)間的增加均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，其中在液固比為10mL/g時(shí)總黃酮提取率出現(xiàn)顯著差異（P＜0.05），而總黃酮提取率受提取溫度和提取時(shí)間的影響較小，組間差異不顯著（P＞0.05）。在液固比為20mL/g 時(shí)總黃酮提取率最高為3.031%，提取溫度為70℃時(shí)總黃酮提取率最高為2.901%，提取時(shí)間為1.5h時(shí)總黃酮提取率最高為2.786%。

表2 不同因素及不同提取水平下藜蒿葉總黃酮提取率

2.2 正交實(shí)驗(yàn)

正交實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)方案以及實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知藜蒿葉總黃酮提取的最佳提取組合為A2B1C2。由表3 中R 值可知藜蒿葉總黃酮提取率的影響大小因素依次是A＞B＞C，即液固比大于提取溫度大于提取時(shí)間。在表3中提取率最高的組合為A2B1C2，提取率為3.960%即液固比15mL/g、提取溫度60℃、提取時(shí)間1.5h。在表3 中由K 值可知藜蒿葉總黃酮的最佳提取工藝組合為A2B1C2。

表3 藜蒿葉總黃酮測(cè)定的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

藜蒿葉中總黃酮提取的方差分析結(jié)果見(jiàn)表4。由表4中F值可知FA＞FB＞FC，F(xiàn)值的大小可以判斷出各因素對(duì)藜蒿葉總黃酮提取率的影響大小，由結(jié)果可知每個(gè)因素對(duì)提取率的影響都不同，影響大小依次是液固比、提取溫度、提取時(shí)間，其中液固比對(duì)藜蒿葉中總黃酮提取率的影響顯著。

表4 藜蒿葉中總黃酮提取的方差分析結(jié)果

3 討論

3.1 單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)藜蒿葉總黃酮提取率的影響

3.1.1 液固比對(duì)藜蒿葉總黃酮提取率的影響

以液固比為變量（5、10、15、20、25mL/g），而其他條件均為固定量（提取溫度70℃，提取時(shí)間為1.5h）進(jìn)行總黃酮提取的單因素實(shí)驗(yàn)（見(jiàn)圖1）。由圖1可以看出液固比在5～20mL/g時(shí)，藜蒿葉中總黃酮的提取率逐漸升高?？赡茉蚴钱?dāng)液固比較低時(shí)液體量不足，不能充分浸泡藜蒿葉粉末，導(dǎo)致總黃酮的提取不完全；當(dāng)繼續(xù)增大液體量時(shí)，提取已較為完全，變化趨勢(shì)波動(dòng)不大；當(dāng)液固比太大時(shí)，溶劑用量大，體系升溫速率變慢從而影響提取效果使得提取率降低。所以液固比在20mL/g時(shí)總黃酮的提取率最高為3.031%。

圖1 液固比對(duì)藜蒿葉總黃酮提取的影響

3.1.2 提取溫度對(duì)藜蒿葉總黃酮提取率的影響

以提取溫度為變量（40、50、60、70、80℃），而其他條件均為固定量（液固比20mL/g，提取時(shí)間為1.5h）進(jìn)行總黃酮提取的單因素實(shí)驗(yàn)（見(jiàn)圖2）。由圖2 可以看出提取溫度在40～70℃時(shí)藜蒿葉總黃酮的提取率不斷增高?？赡茉蚴菧囟壬?，分子運(yùn)動(dòng)劇烈，加快了總黃酮的溶出，增大了提取率；溫度過(guò)高時(shí)，由于黃酮類(lèi)化合物有一定的熱敏性導(dǎo)致其分子結(jié)構(gòu)被破壞而分解，使得提取率下降。所以提取溫度在70℃時(shí)總黃酮的提取率最高為2.901%。

圖2 提取溫度對(duì)藜蒿葉總黃酮提取的影響

3.1.3 提取時(shí)間對(duì)藜蒿葉總黃酮提取率的影響

以提取時(shí)間為變量（0.5、1、1.5、2、2.5h），而其他條件均為固定量（液固比20mL/g，提取溫度為70℃）進(jìn)行總黃酮提取的單因素實(shí)驗(yàn)（見(jiàn)圖3）。由圖3可以看出提取時(shí)間在0.5～1.5h時(shí)藜蒿葉總黃酮的提取率不斷增高?？赡茉蚴翘崛r(shí)間過(guò)短，總黃酮不能充分溶出致使提取率較低；提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，總黃酮受熱時(shí)間長(zhǎng)，其中主要成分部分發(fā)生熱分解損失，造成提取率的下降。所以提取溫度在1.5h時(shí)總黃酮的提取率最高為2.786%。

圖3 提取時(shí)間對(duì)藜蒿葉總黃酮提取的影響

3.2 正交實(shí)驗(yàn)對(duì)藜蒿葉總黃酮提取率的影響

由正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知藜蒿葉中提取總黃酮的最佳提取條件是液固比15mL/g、提取溫度60℃、提取時(shí)間1.5h，而單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果中顯示當(dāng)液固比為變量時(shí)，液固比為20mL/g總黃酮提取率最大；提取溫度為變量時(shí)，提取溫度為70℃總黃酮提取率最大；提取時(shí)間為變量時(shí)，提取時(shí)間為1.5h 總黃酮提取率最大。經(jīng)過(guò)兩種實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)比，發(fā)現(xiàn)單因素實(shí)驗(yàn)最佳提取條件與正交實(shí)驗(yàn)最佳提取條件不完全符合，可能原因是針對(duì)藜蒿葉中提取總黃酮而言不同因素之間存在相互影響作用。

4 結(jié)論

藜蒿作為大家喜愛(ài)的一種鄱陽(yáng)湖特色時(shí)令蔬菜，主要食用其莖，而葉被丟棄造成一種浪費(fèi)，所以本實(shí)驗(yàn)通過(guò)乙醇回流法對(duì)藜蒿葉中總黃酮進(jìn)行提取并研究探討了提取工藝的優(yōu)化。經(jīng)實(shí)驗(yàn)測(cè)得在液固比15mL/g、提取溫度60℃、提取時(shí)間1.5h 的條件下藜蒿葉中總黃酮得率最高為3.960%，且液固比對(duì)藜蒿葉中總黃酮提取率有顯著影響。