伍桂榮，崔 彬

廉江市人民醫(yī)院，廣東 廉江 524400

原發(fā)性胃癌是消化系統(tǒng)最多見的惡性腫瘤，患者早期臨床表現(xiàn)輕微、確診率較低［1］。早期確診胃癌并判斷其惡性程度，是選擇合理的治療方案、優(yōu)化患者治療結(jié)局的關(guān)鍵，尋找在胃癌發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色的分子也是今年研究的重點(diǎn)。P311是一種新發(fā)現(xiàn)的蛋白，目前被發(fā)現(xiàn)對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的遷移具有一定調(diào)節(jié)作用，但其在胃癌發(fā)生發(fā)展中扮演的角色未明確［2-3］。本次研究檢測胃癌組織中P311 蛋白的表達(dá)，并進(jìn)一步探討P311 蛋白表達(dá)量對腫瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響，以期為遠(yuǎn)期胃癌診斷及病情判斷奠定一定實(shí)踐基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 病例資料

選取2017年7月—2019年3月間在廉江市人民醫(yī)院接受手術(shù)治療的胃癌患者110例作為研究對象，患者本人及家屬簽署知情同意書。入組標(biāo)準(zhǔn)：（1）經(jīng)組織病理檢查確診原發(fā)性胃癌；（2）首次確診、未接受系統(tǒng)放化療；（3）年齡18～80 周歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并全身感染性疾??；（2）合并嚴(yán)重心肝腎功能不全；（3）合并其他組織臟器惡性腫瘤性疾病。根據(jù)腫瘤分期將110例患者分為早中期胃癌組61 例、晚期胃癌組49 例；另取同期在本院進(jìn)行胃鏡檢查的淺表性胃炎患者50例作為胃炎組。早中期胃癌組中男性32 例、女性29 例，年齡37～72 歲，平均年齡（56.27±8.95）歲；晚期胃癌組中男性25 例、女性24 例，年齡40～73歲，平均年齡（57.18±8.73）歲；胃炎組中男性27例、女性23 例，年齡35～71 歲，平均年齡（54.39±9.11）歲。三組研究對象的性別、年齡分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），研究獲本院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 P311蛋白：取早中期胃癌組、晚期胃癌組患者的腫瘤組織標(biāo)本，胃炎組患者的病灶區(qū)域組織標(biāo)本。加入蛋白裂解液（上海邦奕生物科技有限公司，貨號BB-3221）并研磨組織，懸液于低溫離心機(jī)（北京時代北利離心機(jī)有限公司，貨號GTR10-1）12 000 r/min 離心20 min，棄沉淀、保留上層蛋白樣本，參照western-blotting 實(shí)驗(yàn)步驟（垂直電泳、電轉(zhuǎn)膜、脫脂牛奶封閉、特異性第一抗體孵育、第二抗體孵育、ECL顯影）進(jìn)行操作。使用Image J軟件計算蛋白條帶的灰度值，設(shè)置胃炎組患者組織標(biāo)本中P311 蛋白表達(dá)量為標(biāo)準(zhǔn)值100，計算早中期胃癌組、晚期胃癌組腫瘤組織標(biāo)本中P311蛋白的相應(yīng)表達(dá)量。

1.2.2 增殖、侵襲、自噬基因mRNA表達(dá)：取早中期胃癌組、晚期胃癌組患者的腫瘤組織標(biāo)本，胃炎組患者的病灶區(qū)域組織標(biāo)本，加入Trizol試劑（上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司，貨號GMS12279）裂解細(xì)胞，加入0.2 ml氯仿（上海甄準(zhǔn)生物科技有限公司，貨號ZCH-1350.1）并低溫、12 000 rpm/min離心10～15 min，取上層水相。加入等體積異丙醇（上海羽朵生物科技有限公司，YDM8398）沉淀其中總RNA，經(jīng)75%乙醇（上海魯汶生物科技有限公司，規(guī)格型號LWJSKJ025-608）洗滌后室溫（25℃左右）干燥5～10 min。采用紫外光吸收法測定其RNA純度，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Biomiga 科技公司，貨號RT021301）合成樣品cDNA，反應(yīng)體系如下：buffer 2 μL、上下游引物各0.2μL、dNTP 0.1μL、MMLV 0.5μL、DEPC 水 5μL、RNA 模板 2μL。具體上下游引物如下：EZH2 上游5’-AGCGTAGTAGGCTACTTGAT-3’，下 游 5’-CGATGATGCCAGACTGAGGA-3’； I2PP2A 上 游 5’-AGCGATGAGCTGATGACGTAG-3’，下游 5’-CGAGGCTGATCGATGAGTAG-3’；CyclinD1 上 游 5’-GCGTGATGCCAATGATGAT-3’，下 游5’-AGCGACGTAGTAGCGATGA-3’；p16上游5’-AGTGCGTACAGTAAGTTGC-3’，下 游 5’-CGTGAACGTAGGAAC-GAAT-3’；ARK5上游5’-AGCTGATGACGATGAGAAC-3’，下 游 5’-CGTAGTAGTAGCAGTAGCAG-3’；Ezrin 上 游5’-AGCGATTAGCCAGATGCAG-3’，下游 5’-CGTAGCTGAACGTAGTAG-3’；Sema3A 上 游 5’-AGTCGAACGTAGAACGTAG-3’，下 游 5’-CGTGATGACGATGAGTAGT-3’；SIRT1 上游5’-ACGTGATGACCGATGATGA-3’，下 游 5’-CGTAGTACGAATGATGAGC-3’；MMP-9 上 游5’-CGTAGTGACGTAGGTAGCGA-3’，下 游 5’-TGACGTAGCAAGACTGAGTA-3’；Beclin1 上游 5’-ACGTGTAACGAACTGATGCA-3’，下 游 5’-CTACGTAGCAACGTAGCA-3’；MAPLC3 上 游 5’-ATGCTGACCGAACTGAGCAGT-3’，下游5’-ACGATGACGATGAGGATCA-3’；LC3上游5’-ACGTGAACCGTAGATGCGAA-3’，下游5’-TGACGTAACGTAGCGATCA-3’。經(jīng)熒光定量PCR試劑盒（上海澤葉生物科技有限公司，貨號ZY-F1987）上述目標(biāo)基因的mRNA擴(kuò)增。在計算機(jī)軟件中獲取相應(yīng)PCR擴(kuò)增曲線，設(shè)置胃炎組患者組織標(biāo)本中基因mRNA 表達(dá)量為標(biāo)準(zhǔn)值100，計算早中期胃癌組、晚期胃癌組腫瘤組織標(biāo)本中目標(biāo)基因mRNA的相應(yīng)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，P311 蛋白表達(dá)量，增殖基因、侵襲基因、自噬基因mRNA表達(dá)量等計量資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用t 檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Pearson檢驗(yàn)；以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 P311蛋白

三組研究對象病灶組織中P311 蛋白表達(dá)量差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。早中期胃癌組、晚期胃癌組的P311蛋白表達(dá)量顯著高于胃炎組，且晚期胃癌組的P311 蛋白表達(dá)量高于早中期胃癌組，組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖1。

2.2 增殖基因mRNA表達(dá)

圖1 三組研究對象病灶組織中P311蛋白表達(dá)量比較

三組研究對象病灶組織中增殖基因EZH2、I2PP2A、CyclinD1、p16 的mRNA 表達(dá)量差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。早中期胃癌組、晚期胃癌組的增殖基因EZH2、I2PP2A、CyclinD1 的 mRNA 表達(dá)量高于胃炎組，p16 的mRNA 表達(dá)量低于胃炎組，且晚期胃癌組上述基因mRNA表達(dá)量變化大于早中期胃癌組，組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

2.3 侵襲基因mRNA表達(dá)

三組研究對象病灶組織中侵襲基因ARK5、Ezrin、Sema3A、SIRT1、MMP-9的mRNA表達(dá)量差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。早中期胃癌組、晚期胃癌組的侵襲基因ARK5、Ezrin、SIRT1、MMP-9 的 mRNA 表達(dá)量高于胃炎組，Sema3A 的mRNA 表達(dá)量低于胃炎組，且晚期胃癌組上述基因mRNA表達(dá)量變化大于早中期胃癌組，組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

2.4 自噬基因mRNA表達(dá)

三組研究對象病灶組織中自噬基因Beclin1、MAPLC3、LC3 的mRNA 表達(dá)量差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。早中期胃癌組、晚期胃癌組的自噬基因Beclin1、MAPLC3 mRNA 表達(dá)量低于胃炎組，LC3 mRNA 表達(dá)量高于胃炎組，且晚期胃癌組上述基因mRNA表達(dá)量變化大于早中期胃癌組，組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

表1 三組研究對象病灶組織中增殖基因mRNA表達(dá)量比較（）

表1 三組研究對象病灶組織中增殖基因mRNA表達(dá)量比較（）

注：與胃炎組比較，aP＜0.05；與早中期胃癌組比較，bP＜0.05。

組別胃炎組（n=50）早中期胃癌組（n=61）晚期胃癌組（n=49）F P EZH2 100 145.37±20.88a 199.25±24.94ab 20.187 0.000 I2PP2A 100 131.28±14.72a 178.63±22.94ab 16.384 0.000 CyclinD1 100 124.58±14.76a 169.77±20.83ab 17.037 0.000 p16 100 68.25±8.19a 37.92±5.81ab 11.263 0.000

表2 三組研究對象病灶組織中侵襲基因mRNA表達(dá)量比較（）

表2 三組研究對象病灶組織中侵襲基因mRNA表達(dá)量比較（）

注：與胃炎組比較，aP＜0.05；與早中期胃癌組比較，bP＜0.05。

組別胃炎組（n=50）早中期胃癌組（n=61）晚期胃癌組（n=49）F P ARK5 100 140.93±17.39a 191.76±24.85ab 151.28 0.000 Ezrin 100 137.66±16.09a 178.53±21.62ab 14.095 0.000 Sema3A 100 76.38±9.17a 42.94±6.08ab 10.827 0.000 SIRT1 100 133.28±15.97a 203.48±27.93ab 20.661 0.000 MMP-9 100 138.72±16.88a 183.25±21.74ab 17.384 0.000

表3 三組研究對象病灶組織中自噬基因mRNA表達(dá)量比較（）

表3 三組研究對象病灶組織中自噬基因mRNA表達(dá)量比較（）

注：與胃炎組比較，aP＜0.05；與早中期胃癌組比較，bP＜0.05。

組別胃炎組（n=50）早中期胃癌組（n=61）晚期胃癌組（n=49）F P Beclin1 100 68.23±8.11a 39.46±5.37ab 10.921 0.000 MAPLC3 100 71.39±8.64a 42.18±5.73ab 9.042 0.000 LC3 100 142.73±17.92a 186.42±22.85ab 13.274 0.000

2.5 相關(guān)性分析

胃癌組織中，P311蛋白表達(dá)量與增殖、侵襲、自噬基因的mRNA表達(dá)量均呈直接相關(guān)關(guān)系（P＜0.05），見表4。

表4 胃癌組織P311蛋白表達(dá)量與惡性分子mRNA表達(dá)量的相關(guān)關(guān)系

3 討論

P311是新近發(fā)現(xiàn)的可能與腫瘤細(xì)胞遷移密切相關(guān)的蛋白，具體證據(jù)如下：（1）P311 基因在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織呈高表達(dá)，且與黏著斑蛋白等遷移相關(guān)蛋白存在共定位關(guān)系；（2）P311基因在非小細(xì)胞肺癌組織中呈高表達(dá)，且與癌細(xì)胞浸潤程度相關(guān)；（3）P311可促進(jìn)創(chuàng)傷肌肉組織中成纖維母細(xì)胞的遷移［4-6］。有學(xué)者推測，P311 蛋白可能在胃癌細(xì)胞的增殖侵襲過程中也發(fā)揮重要作用，但目前相關(guān)研究開展甚少。本次研究首先對比胃癌組織及淺表性胃炎組織中P311 蛋白的表達(dá)差異發(fā)現(xiàn)：胃癌組織中P311 蛋白表達(dá)量顯著高于胃炎組，且晚期胃癌組織中P311 蛋白表達(dá)量高于早中期胃癌組織。上述結(jié)果說明P311 蛋白高表達(dá)參與了胃癌的發(fā)生發(fā)展，但具體P311 蛋白表達(dá)量對胃癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響有待研究明確。

腫瘤細(xì)胞程序性凋亡抑制/增殖活性增強(qiáng)，是惡性腫瘤發(fā)生的核心原因，檢測增殖相關(guān)基因的表達(dá)量可客觀反映腫瘤惡性程度［7-8］。EZH2 屬于多梳蛋白基因家族成員，在多種惡性腫瘤組織中呈高表達(dá)，可將PRC2 復(fù)合物招募至特定的基因位點(diǎn)并抑制多種抑癌基因表達(dá)［9］。I2PP2A基因參與細(xì)胞周期調(diào)控、DNA損傷修復(fù)等多個過程，目前有研究發(fā)現(xiàn)，其在胃癌組織中的表達(dá)量是正常組織的2倍以上，被認(rèn)為是腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)之一。CyclinD1是公認(rèn)的癌基因，其過表達(dá)可激活CDK4/CDK6 并降低細(xì)胞增殖過程中對有絲分裂原的依賴，造成細(xì)胞周期調(diào)節(jié)失控、細(xì)胞增殖異常。p16屬于重要的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)物，在G1/S期發(fā)揮重要的負(fù)向調(diào)控作用，通過與CyclinD1 競爭性結(jié)合CDK4 并組織細(xì)胞進(jìn)入S 期，使細(xì)胞周期停滯從而發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞增值的作用［10-11］。本次研究對比各組研究對象病灶組織中上述增殖基因的mRNA表達(dá)量發(fā)現(xiàn)：胃癌組織中EZH2、I2PP2A、CyclinD1 的mRNA 表達(dá)量高于胃炎組，p16 的mRNA 表達(dá)量低于胃炎組，且隨腫瘤分期增加、上述基因的mRNA表達(dá)量改變程度加劇，這與既往研究結(jié)果基本一致，說明增殖基因表達(dá)異常是胃癌發(fā)生發(fā)展的重要因素。文中進(jìn)一步經(jīng)Pearson 檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中P311 蛋白表達(dá)量與增殖基因EZH2、I2PP2A、CyclinD1 mRNA 表達(dá)量呈正相關(guān)，與p16 mRNA 表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)，證實(shí)胃癌組織中P311 蛋白表達(dá)量與腫瘤細(xì)胞增殖活性密切相關(guān)。

侵襲遷移是腫瘤細(xì)胞惡性程度增加、發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的核心機(jī)制，其發(fā)生的分子基礎(chǔ)是侵襲基因的表達(dá)異常。ARK5是Akt的下游信號分子，癌組織血供不足可導(dǎo)致Akt激活及ARK5基因表達(dá)增加，促使腫瘤細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移。Ezrin對細(xì)胞黏附、生長、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程起調(diào)節(jié)作用，目前有研究證實(shí)其通過上調(diào)YAP 表達(dá)而促進(jìn)胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移［12］。Sema3A是3型Semaphorin家族的抑癌成員，可通過多種信號通路抑制腫瘤增殖侵襲，目前已經(jīng)發(fā)生其在多種惡性腫瘤中表達(dá)下調(diào)甚至缺失。SIRT1在細(xì)胞增殖、能量代謝等多個過程中均發(fā)揮重要作用，研究表明SIRT1 可阻斷p53依賴的轉(zhuǎn)錄及凋亡過程，發(fā)揮促癌基因的作用［13-14］。MMP-9 是具有分解細(xì)胞外基質(zhì)作用的物質(zhì)，在腫瘤發(fā)生過程中可降低細(xì)胞間黏附作用并促使腫瘤細(xì)胞遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移［15-16］。本次研究發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中侵襲基因ARK5、Ezrin、SIRT1、MMP-9的mRNA表達(dá)量高于胃炎組，Sema3A的mRNA表達(dá)量低于胃炎組，且晚期胃癌組織中上述基因的異常表達(dá)更甚，結(jié)合各個基因的生理作用，說明侵襲基因的異常表達(dá)直接參與了胃癌的發(fā)生及進(jìn)展。經(jīng)Pearson檢驗(yàn)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中P311 蛋白表達(dá)量與ARK5、Ezrin、SIRT1、MMP-9 mRNA 表達(dá)量呈正相關(guān)，與Sema3A mRNA表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)，證實(shí)胃癌組織中P311蛋白表達(dá)量與腫瘤細(xì)胞侵襲活性一致。

自噬是在應(yīng)激狀態(tài)下細(xì)胞自我消化的過程，近年越來越多的研究證實(shí)自噬在腫瘤細(xì)胞生長、分化等過程中扮演重要角色［17-19］。Beclin1、MAPLC3 屬于自噬正向調(diào)控基因，其功能缺失以導(dǎo)致自發(fā)性腫瘤發(fā)生。LC3是自噬體的標(biāo)志性分子，其介導(dǎo)的自噬作用在多種胃部疾患中均扮演重要角色［20-21］。已經(jīng)有國內(nèi)學(xué)者的研究指出，LC3 基因在胃癌組織中呈高表達(dá)，與胃癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本次研究對比各組研究對象病灶組織中上述自噬基因的表達(dá)量發(fā)現(xiàn)：胃癌組織中自噬基因Beclin1、MAPLC3 mRNA表達(dá)量低于胃炎組，LC3 mRNA表達(dá)量高于胃炎組，且隨胃癌惡性程度增加，以上基因的mRNA表達(dá)量變化加劇。經(jīng)Pearson 檢驗(yàn)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中P311 蛋白表達(dá)量與Beclin1、MAPLC3 mRNA 表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)，與LC3 mRNA表達(dá)量呈正相關(guān)，證實(shí)P311 蛋白表達(dá)量檢測可用于胃癌患者的自噬活性判斷。

綜上所述，胃癌組織中P311 蛋白表達(dá)量異常增高，且其具體表達(dá)量與腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、自噬等惡性生物學(xué)行為直接相關(guān)。檢測P311 蛋白表達(dá)量可作為胃癌早期診斷、病情判斷等的重要輔助手段，值得在日后臨床實(shí)踐中推廣應(yīng)用。