李備，張來明，李文杰

（1.中國科學(xué)院長春光學(xué)精密機(jī)械與物理研究所，吉林長春 130033；2.長春長光辰英生物科學(xué)儀器有限公司，吉林長春 130033）

微生物是地球上最多樣化和最豐富的細(xì)胞生命形式[1]。培養(yǎng)法是最常見的微生物研究方法，但自然界中99%微生物難以被培養(yǎng)，且脫離了原始生活環(huán)境，也很難反映其真實(shí)的生態(tài)功能[2-3]。

目前微生物研究主要通過宏基因組學(xué)來進(jìn)行[4-5],此方法可以揭示微生物多樣性并發(fā)現(xiàn)新基因，但無法區(qū)分、驗(yàn)證單個(gè)細(xì)胞的生態(tài)功能[6]。單細(xì)胞技術(shù)能夠可逐一表征微生物在其原生群落中的特性，建立表型與基因型的關(guān)聯(lián)，為微生物研究提供新思路[3,7]。

單細(xì)胞技術(shù)包括特征細(xì)胞的識別、單細(xì)胞分選以及單細(xì)胞測序等分析過程。

單細(xì)胞拉曼光譜作為一種非標(biāo)記、原位的識別方法，能夠表征細(xì)胞的核酸、蛋白質(zhì)、脂肪等代謝物質(zhì)的組成與含量，并依據(jù)這些細(xì)胞固有生化信息來區(qū)分不同種屬的微生物。傳統(tǒng)單細(xì)胞分離方法有流式細(xì)胞術(shù)[8-9]、激光顯微切割[10]等，但由于微生物通常尺寸很小，難以使用這些方法實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確分離[11]?；诩す馀c物質(zhì)相互作用原理的細(xì)胞分離技術(shù)具有準(zhǔn)確率高、適用性廣等特點(diǎn)，適用于微生物單細(xì)胞的分選[12]。本文結(jié)合拉曼光譜技術(shù)與單細(xì)胞分選技術(shù)，實(shí)現(xiàn)對微生物單細(xì)胞的非標(biāo)記識別與精準(zhǔn)分選。

本研究選用大腸桿菌、鼠李糖乳酸桿菌、芽孢桿菌、放線菌和稻瘟菌等常見的微生物菌株，在單細(xì)胞水平上進(jìn)行多種微生物拉曼光譜的檢測，采用聚類分析算法，實(shí)現(xiàn)對不同微生物拉曼光譜數(shù)據(jù)的聚類分析，并應(yīng)用單細(xì)胞分選技術(shù)成功將大腸桿菌分離出來，用于單細(xì)胞基因研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

MDA試劑盒（REPLI-g Single Cell Kit, Qiagen）；TaqDNA聚合酶（2×EasyTaq? PCR SuperMix，北京全式金生物）；微生物培養(yǎng)基（Luria-Bertani液體培養(yǎng)基，索萊寶）；單細(xì)胞分選芯片（Sorting Chip，長春長光辰英生物科學(xué)儀器有限公司）；生物共聚焦拉曼光譜儀（HOOKE P300，長春長光辰英生物科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 微生物的培養(yǎng)與制備

取過夜培養(yǎng)的細(xì)胞懸液，將其稀釋至合適濃度，滴加至單細(xì)胞分選芯片上。

1.3 微生物拉曼光譜分析

通過生物共聚焦拉曼光譜儀獲得拉曼光譜，選用532 nm激光器，檢測功率為5 mW，積分時(shí)間為3 s。

1.4 目標(biāo)微生物單細(xì)胞分選

將芯片及接收器分別放在載物臺與接收裝置中，調(diào)節(jié)物鏡聚焦至樣品面，根據(jù)微生物的拉曼圖譜信息分選目標(biāo)細(xì)胞至接收器。離心將液體轉(zhuǎn)移至無菌PCR管中。

1.5 單細(xì)胞基因組擴(kuò)增

按照REPLI-g Single Cell Kit操作流程完成基因組擴(kuò)增。具體方法為：向4 μL細(xì)胞懸液中加入3 μL裂解液，65 ℃孵育10 min，向反應(yīng)管中依次加入3 μL終止液與40 μL擴(kuò)增反應(yīng)液（9 μL H2O，29 μL Reaction Buffer，2 μL DNA Polymerase），30 ℃孵育8～12 h，65 ℃孵育 3 min，使酶失活。

1.6 微生物鑒定

選取16s rRNA通用引物27F、1492R，使用TaqDNA Polymerase對全基組擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行PCR鑒定。

2 結(jié)果

2.1 微生物單細(xì)胞的拉曼光譜檢測與分析

選取9種微生物培養(yǎng)過夜后制片，應(yīng)用拉曼光譜儀檢測每種菌的單細(xì)胞拉曼光譜，結(jié)果見圖1。對全部原始拉曼光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行去除宇宙射線、消除光譜基線漂移、去除光譜背景噪音、對特定峰位進(jìn)行歸一化等處理。應(yīng)用無監(jiān)督學(xué)習(xí)策略對拉曼光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析，根據(jù)定義在特征空間的距離來度量不同拉曼光譜數(shù)據(jù)的相似性，把相異性的拉曼光譜數(shù)據(jù)分類到不同的簇中，觀察每一簇?cái)?shù)據(jù)的特征，實(shí)現(xiàn)基于拉曼光譜的微生物種類鑒別。

圖1 9種微生物的拉曼光譜圖

2.2 大腸桿菌的分選

通過對拉曼光譜的分析，確定大腸桿菌的特征圖譜，識別樣品中的大腸桿菌，應(yīng)用單細(xì)胞分選儀，將大腸桿菌單細(xì)胞從分選芯片上分離至接收器中，以此來獲得大腸桿菌。如圖2所示，分選前，在芯片上可以清晰地觀察到微生物單細(xì)胞，經(jīng)過細(xì)胞分離操作，目標(biāo)菌從芯片上消失，被分選至接收器，而非目標(biāo)細(xì)胞保持不變。

圖2 單細(xì)胞分選儀分選大腸桿菌

2.3 分選細(xì)胞鑒定

由于單個(gè)微生物細(xì)胞的基因組含量非常低，達(dá)不到基因檢測對樣品量的需求。為了實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞的基因信息分析，我們使用多重置換擴(kuò)增技術(shù)（MDA）對分選得到的單細(xì)胞進(jìn)行全基因組擴(kuò)增，獲得目標(biāo)微生物單細(xì)胞的全基因組產(chǎn)物。隨后以全基因組擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，進(jìn)行細(xì)菌的16s rRNA PCR擴(kuò)增，瓊脂糖電泳結(jié)果見圖3。如圖3所示，分選細(xì)胞的16s rRNA PCR為陽性，證明此全基因組產(chǎn)物是細(xì)菌的基因組；而對照組無條帶，說明分選和擴(kuò)增過程中無外源微生物或基因污染。將此16s rRNA擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，鑒定如圖4所示，證明此分選細(xì)胞為大腸桿菌。

圖3 DNA瓊脂糖電泳鑒定16S PCR分選接收樣品

圖4 PCR產(chǎn)物測序結(jié)果比對

3 結(jié)論

選用實(shí)驗(yàn)室最常用的大腸桿菌作為研究對象，利用單細(xì)胞拉曼分選，經(jīng)過微生物拉曼檢測、微生物單細(xì)胞分選、單細(xì)胞擴(kuò)增及測序鑒定這3個(gè)步驟，成功從復(fù)雜樣品中分離出了目標(biāo)微生物，證明了應(yīng)用單細(xì)胞分選技術(shù)在微生物識別與分離鑒定應(yīng)用方面的可行性。本研究使用的單細(xì)胞分選技術(shù)可以完成1～20 μm大小的微生物分選，該方法為未知標(biāo)記方法及難以培養(yǎng)的微生物的研究提供了可能。相比于宏基因組學(xué)方法，該方法可以得到期望的細(xì)胞個(gè)體乃至特定的細(xì)胞群體，并能夠明確對應(yīng)細(xì)胞的基因型，這有助于對其狀態(tài)、內(nèi)部通路和特殊功能的研究。