李備，張來明，李文杰

（1.中國科學院長春光學精密機械與物理研究所，吉林長春 130033；2.長春長光辰英生物科學儀器有限公司，吉林長春 130033）

微生物是地球上最多樣化和最豐富的細胞生命形式[1]。培養(yǎng)法是最常見的微生物研究方法，但自然界中99%微生物難以被培養(yǎng)，且脫離了原始生活環(huán)境，也很難反映其真實的生態(tài)功能[2-3]。

目前微生物研究主要通過宏基因組學來進行[4-5],此方法可以揭示微生物多樣性并發(fā)現(xiàn)新基因，但無法區(qū)分、驗證單個細胞的生態(tài)功能[6]。單細胞技術能夠可逐一表征微生物在其原生群落中的特性，建立表型與基因型的關聯(lián)，為微生物研究提供新思路[3,7]。

單細胞技術包括特征細胞的識別、單細胞分選以及單細胞測序等分析過程。

單細胞拉曼光譜作為一種非標記、原位的識別方法，能夠表征細胞的核酸、蛋白質、脂肪等代謝物質的組成與含量，并依據(jù)這些細胞固有生化信息來區(qū)分不同種屬的微生物。傳統(tǒng)單細胞分離方法有流式細胞術[8-9]、激光顯微切割[10]等，但由于微生物通常尺寸很小，難以使用這些方法實現(xiàn)準確分離[11]?；诩す馀c物質相互作用原理的細胞分離技術具有準確率高、適用性廣等特點，適用于微生物單細胞的分選[12]。本文結合拉曼光譜技術與單細胞分選技術，實現(xiàn)對微生物單細胞的非標記識別與精準分選。

本研究選用大腸桿菌、鼠李糖乳酸桿菌、芽孢桿菌、放線菌和稻瘟菌等常見的微生物菌株，在單細胞水平上進行多種微生物拉曼光譜的檢測，采用聚類分析算法，實現(xiàn)對不同微生物拉曼光譜數(shù)據(jù)的聚類分析，并應用單細胞分選技術成功將大腸桿菌分離出來，用于單細胞基因研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

MDA試劑盒（REPLI-g Single Cell Kit, Qiagen）；TaqDNA聚合酶（2×EasyTaq? PCR SuperMix，北京全式金生物）；微生物培養(yǎng)基（Luria-Bertani液體培養(yǎng)基，索萊寶）；單細胞分選芯片（Sorting Chip，長春長光辰英生物科學儀器有限公司）；生物共聚焦拉曼光譜儀（HOOKE P300，長春長光辰英生物科學儀器有限公司）。

1.2 微生物的培養(yǎng)與制備

取過夜培養(yǎng)的細胞懸液，將其稀釋至合適濃度，滴加至單細胞分選芯片上。

1.3 微生物拉曼光譜分析

通過生物共聚焦拉曼光譜儀獲得拉曼光譜，選用532 nm激光器，檢測功率為5 mW，積分時間為3 s。

1.4 目標微生物單細胞分選

將芯片及接收器分別放在載物臺與接收裝置中，調節(jié)物鏡聚焦至樣品面，根據(jù)微生物的拉曼圖譜信息分選目標細胞至接收器。離心將液體轉移至無菌PCR管中。

1.5 單細胞基因組擴增

按照REPLI-g Single Cell Kit操作流程完成基因組擴增。具體方法為：向4 μL細胞懸液中加入3 μL裂解液，65 ℃孵育10 min，向反應管中依次加入3 μL終止液與40 μL擴增反應液（9 μL H2O，29 μL Reaction Buffer，2 μL DNA Polymerase），30 ℃孵育8～12 h，65 ℃孵育 3 min，使酶失活。

1.6 微生物鑒定

選取16s rRNA通用引物27F、1492R，使用TaqDNA Polymerase對全基組擴增產物進行PCR鑒定。

2 結果

2.1 微生物單細胞的拉曼光譜檢測與分析

選取9種微生物培養(yǎng)過夜后制片，應用拉曼光譜儀檢測每種菌的單細胞拉曼光譜，結果見圖1。對全部原始拉曼光譜數(shù)據(jù)進行去除宇宙射線、消除光譜基線漂移、去除光譜背景噪音、對特定峰位進行歸一化等處理。應用無監(jiān)督學習策略對拉曼光譜數(shù)據(jù)進行聚類分析，根據(jù)定義在特征空間的距離來度量不同拉曼光譜數(shù)據(jù)的相似性，把相異性的拉曼光譜數(shù)據(jù)分類到不同的簇中，觀察每一簇數(shù)據(jù)的特征，實現(xiàn)基于拉曼光譜的微生物種類鑒別。

圖1 9種微生物的拉曼光譜圖

2.2 大腸桿菌的分選

通過對拉曼光譜的分析，確定大腸桿菌的特征圖譜，識別樣品中的大腸桿菌，應用單細胞分選儀，將大腸桿菌單細胞從分選芯片上分離至接收器中，以此來獲得大腸桿菌。如圖2所示，分選前，在芯片上可以清晰地觀察到微生物單細胞，經過細胞分離操作，目標菌從芯片上消失，被分選至接收器，而非目標細胞保持不變。

圖2 單細胞分選儀分選大腸桿菌

2.3 分選細胞鑒定

由于單個微生物細胞的基因組含量非常低，達不到基因檢測對樣品量的需求。為了實現(xiàn)單細胞的基因信息分析，我們使用多重置換擴增技術（MDA）對分選得到的單細胞進行全基因組擴增，獲得目標微生物單細胞的全基因組產物。隨后以全基因組擴增產物為模板，進行細菌的16s rRNA PCR擴增，瓊脂糖電泳結果見圖3。如圖3所示，分選細胞的16s rRNA PCR為陽性，證明此全基因組產物是細菌的基因組；而對照組無條帶，說明分選和擴增過程中無外源微生物或基因污染。將此16s rRNA擴增產物進行測序，鑒定如圖4所示，證明此分選細胞為大腸桿菌。

圖3 DNA瓊脂糖電泳鑒定16S PCR分選接收樣品

圖4 PCR產物測序結果比對

3 結論

選用實驗室最常用的大腸桿菌作為研究對象，利用單細胞拉曼分選，經過微生物拉曼檢測、微生物單細胞分選、單細胞擴增及測序鑒定這3個步驟，成功從復雜樣品中分離出了目標微生物，證明了應用單細胞分選技術在微生物識別與分離鑒定應用方面的可行性。本研究使用的單細胞分選技術可以完成1～20 μm大小的微生物分選，該方法為未知標記方法及難以培養(yǎng)的微生物的研究提供了可能。相比于宏基因組學方法，該方法可以得到期望的細胞個體乃至特定的細胞群體，并能夠明確對應細胞的基因型，這有助于對其狀態(tài)、內部通路和特殊功能的研究。