顧斌濤，熊大維

（江西省科學(xué)院微生物研究所，江西南昌 330096）

根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）是一種存在于土壤中的革蘭氏陰性菌，在自然條件下能感染植物的受傷部位，可以轉(zhuǎn)移腫瘤誘導(dǎo)質(zhì)粒的片段T-DNA（Transfer DNA）導(dǎo)入到植物基因組中。根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法不僅用于植物的轉(zhuǎn)化，而且能用于酵母、曲霉、木霉和蘑菇等真菌的轉(zhuǎn)化，根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法比傳統(tǒng)聚乙二醇介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法效率更高[1-4]。

里氏木霉（Trichoderma reesei）是工業(yè)上重要的產(chǎn)酶菌種，其在纖維素基質(zhì)上生長迅速、培養(yǎng)簡便，發(fā)酵工藝成熟，胞外分泌蛋白能力強(qiáng)，產(chǎn)物分離成本低，在產(chǎn)酶條件下不產(chǎn)生毒素，具有良好的安全性[5]。里氏木霉具有纖維二糖水解酶基因的強(qiáng)啟動子，大量同源或異源的酶基因在里氏木霉中獲得表達(dá)并應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)[6-7]。用里氏木霉作為宿主菌進(jìn)行基因工程改造越來越受到重視，目前對里氏木霉進(jìn)行轉(zhuǎn)化效率較高的方法為根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法[8]。一般研究常用里氏木霉的分生孢子作為其轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞，本研究利用里氏木霉的原生質(zhì)體作為轉(zhuǎn)化受體材料，以期提高根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的效率，方便對里氏木霉遺傳改造時(shí)進(jìn)行大通量的篩選。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

菌株：里氏木霉H7和根癌農(nóng)桿菌AGL-1為實(shí)驗(yàn)室保存。

質(zhì)粒：pCAM-pht01為實(shí)驗(yàn)室保存，根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化載體，含潮霉素基因表達(dá)盒。

PDA培養(yǎng)基：稱取PDA干粉（英國Oxoid公司CM0139）39 g，加入1 L去離子水，攪拌至樣品分散，高壓蒸汽滅菌后傾注平板。

PDA抗性培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基中加入潮霉素B（150 μg/mL）和頭孢霉素（400 μg/mL）。

IM培養(yǎng)基：取1.25 mol/L磷酸緩沖液800 μL，MgSO4-NaCl緩沖液 20 mL，10 mg/mL CaCl2·2H2O溶液1 mL，1 mg/mL FeSO4·7H2O溶液1 mL，微量元素溶液5 mL，200 mg/mL NaNO3溶液2 mL，50%甘油10 mL，1 mol/L MES溶液40 mL，200 mg/mL葡萄糖溶液5 mL，混勻后加入900.7 mL無菌水[9-10]。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)的制備

將根癌農(nóng)桿菌接至含60 μg/mL利福平的LB液體培養(yǎng)基，28 ℃、180 r/min培養(yǎng)48 h，按接種量為10%轉(zhuǎn)接至LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.6左右。將菌液分裝并冰浴15 min，離心棄上清。將根癌農(nóng)桿菌重懸于500 μL預(yù)冷的0.1 μmol/L MgCl2溶液，冰浴10 min。離心棄上清，加入100 μL預(yù)冷的0.02 μmol/L的CaCl2溶液重懸菌液，冰浴20 min。

1.2.2 質(zhì)粒導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌

在農(nóng)桿菌中加入5 μL的質(zhì)粒輕輕混合，冰浴15 min后放入液氮冷凍1 min。冷凍后在37 ℃的水浴中放置3 min，再立即冰浴2 min，加入450 μL的LB液體培養(yǎng)基。在100 r/min和28 ℃的搖床上孵育3 h。然后4 000 r/min離心3 min。棄去約400 μL上清，剩下的液體與菌體沉淀混合，涂布至LB固體抗性平板。在28 ℃條件下培養(yǎng)至轉(zhuǎn)化子長出。

1.2.3 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化里氏木霉

根癌農(nóng)桿菌接LB液體培養(yǎng)基（含利福平25 μg/mL和卡那霉素60 μg/mL）培養(yǎng)36 h；離心收集菌，用IM液體培養(yǎng)基重懸菌至OD660為0.15，添加乙酰丁香酮400 μmol/L，鋁膜避光，在28 ℃和180 r/min的搖床培養(yǎng)至OD660為0.5左右。

里氏木霉接到PDA平板上28 ℃培養(yǎng)7 d，用無菌水從平板上洗下木霉孢子，過濾得孢子液。血球計(jì)數(shù)板對孢子計(jì)數(shù)，8 000 r/min離心2 min，棄去上清，用無菌生理鹽水調(diào)節(jié)孢子液的濃度到106個(gè)/mL。

取上述根癌農(nóng)桿菌和里氏木霉孢子液按體積1∶1混合，然后涂布在IM平板的硝酸纖維素膜上，暗處共培養(yǎng)。將硝酸纖維素膜反鋪到含150 μg/mL潮霉素B和400 μg/mL頭孢霉素的PDA抗性平板上，30 ℃培養(yǎng)至里氏木霉轉(zhuǎn)化子長出。

2 結(jié)果與分析

2.1 根癌農(nóng)桿菌的濃度對轉(zhuǎn)化效率的影響

根癌瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化不同宿主菌的能力不同，過高或過低的農(nóng)桿菌濃度對轉(zhuǎn)化效率有直接的影響，一般處于對數(shù)生長期的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化能力較強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)選擇不同濃度的農(nóng)桿菌（OD660=0.4～1.0）進(jìn)行研究，結(jié)果（圖1）表明根癌農(nóng)桿菌的濃度對轉(zhuǎn)化效率有顯著的影響，根癌農(nóng)桿菌OD660為0.8時(shí)的轉(zhuǎn)化效率最高，當(dāng)OD660超過0.8時(shí)，轉(zhuǎn)化效率反而降低，可能由于過高的菌濃使得培養(yǎng)基中營養(yǎng)不足，降低了農(nóng)桿菌的介導(dǎo)能力。因此實(shí)驗(yàn)最適宜的根癌農(nóng)桿菌菌液OD660為 0.8。

圖1 根癌瘤農(nóng)桿菌濃度對轉(zhuǎn)化效率的影響

2.2 乙酰丁香酮濃度對轉(zhuǎn)化效率的影響

乙酰丁香酮是一種由受傷植物產(chǎn)生的酚類物質(zhì)，在遺傳轉(zhuǎn)化中誘導(dǎo)能力較強(qiáng)，其作用機(jī)制在于能誘導(dǎo)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，刺激腫瘤誘導(dǎo)質(zhì)粒的T-DNA轉(zhuǎn)移并整合到植物或真菌細(xì)胞的基因組中。使用不同濃度的乙酰丁香酮進(jìn)行農(nóng)桿菌和木霉的共培養(yǎng)，結(jié)果如圖2所示。乙酰丁香酮濃度對轉(zhuǎn)化效率的影響是顯著的，在一定范圍內(nèi)，隨乙酰丁香酮濃度的增加轉(zhuǎn)化效率也增加。但過高濃度的乙酰丁香酮影響了轉(zhuǎn)化效率。當(dāng)乙酰丁香酮濃度80 μg/mL時(shí)，轉(zhuǎn)化效率最高，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用乙酰丁香酮濃度為80 μg/mL。

圖2 乙酰丁香酮濃度對轉(zhuǎn)化效率的影響

2.3 共培養(yǎng)時(shí)間對轉(zhuǎn)化效率的影響

研究不同共培養(yǎng)時(shí)間對轉(zhuǎn)化效率的影響，結(jié)果顯示（圖3）共培養(yǎng)12 h時(shí)沒有獲得轉(zhuǎn)化子，隨著共培養(yǎng)時(shí)間的延長，轉(zhuǎn)化效率逐漸提高，共培養(yǎng)48 h轉(zhuǎn)化率最高。共培養(yǎng)時(shí)間過長時(shí)，轉(zhuǎn)化效率反而有些下降，這可能是農(nóng)桿菌過度生長，一方面消耗了培養(yǎng)基的營養(yǎng)，另一方面在后續(xù)培養(yǎng)中產(chǎn)生物理屏障，限制了木霉菌的生長。另外，過長的共培養(yǎng)時(shí)間可能導(dǎo)致轉(zhuǎn)化子菌落會相互重疊，給下一步的篩選帶來困難，因此共培養(yǎng)時(shí)間選擇48 h為宜。

圖3 共培養(yǎng)時(shí)間對轉(zhuǎn)化效率的影響

2.4 共培養(yǎng)溫度對轉(zhuǎn)化效率的影響

共培養(yǎng)溫度對農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化有一定的影響，采用 20 ℃、22 ℃、24 ℃、26 ℃、28 ℃和 30 ℃進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，如圖4的結(jié)果顯示，在一定溫度范圍內(nèi)，轉(zhuǎn)化效率隨著溫度的上升而增加，當(dāng)溫度24 ℃時(shí)轉(zhuǎn)化效率最高，當(dāng)溫度過高時(shí)，轉(zhuǎn)化效率隨著溫度的上升而下降?？赡苡捎诘蜏赜绊懥死锸夏久购娃r(nóng)桿菌的生長，高溫影響了農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化過程中的T-DNA轉(zhuǎn)移機(jī)制。因此實(shí)驗(yàn)選取共培養(yǎng)溫度為24 ℃。

圖4 共培養(yǎng)溫度對轉(zhuǎn)化率的影響

2.5 共培養(yǎng)pH對轉(zhuǎn)化效率的影響

共培養(yǎng)基的pH對菌體的生長和代謝有很大的影響，使用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化一般需要較低的pH值。采用不同的共培養(yǎng)基pH進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，圖5的結(jié)果顯示，當(dāng)共培養(yǎng)基pH為5.2～5.6，具有較高的轉(zhuǎn)化效率，其中以pH在5.4時(shí)轉(zhuǎn)化效率最高，達(dá)到87個(gè)轉(zhuǎn)化子（每106個(gè)細(xì)胞），是以孢子為受體（轉(zhuǎn)化效率46個(gè)轉(zhuǎn)化子/106個(gè)孢子）的1.9倍[11]。

圖5 共培養(yǎng)pH對轉(zhuǎn)化率的影響

3 討論與結(jié)論

絲狀真菌在生產(chǎn)有機(jī)酸、抗生素、酶制劑及藥物活性物質(zhì)中發(fā)揮著重要的作用。作為異源蛋白表達(dá)的細(xì)胞工廠，絲狀真菌具有蛋白分泌能力強(qiáng)、營養(yǎng)需求低、翻譯后修飾加工和產(chǎn)物分離成本低等優(yōu)勢。絲狀真菌有著良好的生物安全性，黑曲霉、里氏木霉和米曲霉等已在食品行業(yè)有長期應(yīng)用。里氏木霉是生產(chǎn)工業(yè)酶制劑的重要菌株，本身能分泌大量的纖維素酶，其纖維素酶酶系組成較為齊全，通過遺傳改造里氏木霉進(jìn)行同源或異源表達(dá)的研究越來越受重視。本研究利用里氏木霉的分生孢子作為其根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的受體細(xì)胞，獲得轉(zhuǎn)化的適宜條件為：根癌農(nóng)桿菌菌液OD660為0.8，乙酰丁香酮濃度為80 μg/mL，共培養(yǎng)時(shí)間選擇48 h，共培養(yǎng)溫度為24 ℃，共培養(yǎng)基pH在5.4。在此條件下，根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的效率達(dá)87個(gè)轉(zhuǎn)化子（每106個(gè)細(xì)胞），高于傳統(tǒng)以分生孢子作為受體細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率。