高林森，柴岳平，溫吉更，李亞麗，郭燁

（1.河北省農(nóng)林科學(xué)院農(nóng)業(yè)信息與經(jīng)濟研究所，河北 石家莊 050051；2.河北省農(nóng)林科學(xué)院，河北 石家莊 050031）

桑葚果是桑屬植物中的一種成熟果實，營養(yǎng)豐富，口感較好，其果肉化學(xué)成分復(fù)雜，藥理作用十分廣泛[1]。桑葚不僅含有鈣、鋅、鐵、錳等礦物質(zhì)元素，還含有胡蘿卜素等黃酮類物質(zhì)以及蘆丁等藥理成分，是國家衛(wèi)生部列出的保健農(nóng)產(chǎn)品之一[2～5]。當(dāng)今，桑葚果汁享有“二十一世紀(jì)的最佳健康食品”之美譽。

桑葚果花色苷對人體具有多種保健功能。桑葚富含多酚類物質(zhì)，其中主要為花色苷類化合物，以桑椹紅作為著色劑已經(jīng)列入我國國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)（GB 2760—2004），有著巨大的加工潛力[6]。早在1972 年，日本學(xué)者報道了桑葚果中的花色苷含有矢車菊-3-葡萄糖苷、牽?；?3-蕓香糖苷和天竺葵-3-葡萄糖苷3 種成分[7]。2004 年Liu 等[8]等通過高效液相色譜法，從桑葚果中分離出4 種花色苷成分。

桑葚具備藥理活性的緣由是其含有某些生物活性物質(zhì)[9]。研究表明，成熟的桑葚果實含有豐富的花色苷物質(zhì)，膳食花色苷具有抗氧化[10，11]、抗腫瘤[12～14]、抗炎癥[15]、抗動脈粥樣硬化[16]等優(yōu)良且廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，尤其是抗腫瘤活性具有天然、低毒、高效等優(yōu)點[17，18]。

將成熟桑葚洗滌、打碎、冷凍干燥，得到桑葚干粉。將桑葚干粉在酸化乙醇中浸泡提取，離心，真空抽濾，濾液旋蒸除去乙醇，石油醚萃取取除去脂類，最后真空抽濾，得到桑葚花色苷粗提物水溶液，待測。并對提取過程中的重要參數(shù)進行了優(yōu)化。確定了最佳提取條件，并對不同地區(qū)生長的桑葚花色苷含量進行了差異性分析，旨為桑葚花色苷的進一步開發(fā)利用提供科研依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

桑葚樣品采自邢臺市、衡水市和滄州市，品種主要有無核大十、黑珍珠、紅果2 號、白玉王、黑珍珠、桂花蜜、紅果2 號、白葚子、臺灣長桑。

試劑有醋酸鈉（純度98%，山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司）、氯化鉀（分析純，天津市紅巖化學(xué)試劑廠）、60～80 ℃石油醚（山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司）、鹽酸（分析純，天津市永大化學(xué)試劑有限公司） 和乙醇（分析純，天津市永大化學(xué)試劑有限公司）。

所用儀器或設(shè)備有冷凍干燥箱、超聲波清洗器、-80 ℃冰箱等（表1）。

表1 試驗儀器或設(shè)備的型號及其生產(chǎn)廠商Table 1 Test instruments and equipments and their manufacturers

1.2 試驗方法

1.2.1 桑葚花色苷的提取 將桑葚清洗干凈，晾干后打漿，冷凍干燥至桑葚干粉，貯存于-80 ℃低溫冰箱中，備用。稱取桑葚干粉0.500 0 g 于試管中，加酸化乙醇溶液（85%乙醇與1.5 mol/L HCl 按照體積比85∶15 配制而成） 20 mL 溶解，60 ℃浸泡提取90 min，將提取液以4 000 r/min 轉(zhuǎn)速離心5 min，取上清液；取沉淀重復(fù)上述操作，合并2 次提取液。真空抽濾2次得到的上清液，將濾液旋蒸除去乙醇，利用石油醚萃取除去脂類[19]，最后真空抽濾，得到桑葚花色苷粗提物水溶液，待測。

1.2.2 花色苷總含量的測定 采用pH 值示差法[20]測定提取物水溶液中的花色苷總含量。將待測提取液定容到10 mL，吸取樣品2 mL 置于2 只試管中，一支試管中加入1 mL pH 值1.0 的緩沖液（0.2 mol/L 氯化鉀溶液與0.2 mol/L 鹽酸溶液按體積比25∶67 配制而成），另一支加入pH 值4.5 的緩沖液（0.2 mol/L 醋酸鈉溶液用0.2 mol/L 鹽酸調(diào)節(jié)pH 值至4.5），得到待測液。以蒸餾水作為空白對照，利用紫外分光光度計，分別在波長520 nm 和700 nm 處測定2 種待測液的吸光值（A）。根據(jù)公式，計算桑葚的花色苷總含量：

桑葚花色苷總含量（mg/g）=（A/εL）×MW×DF×V/M

A=（A510nm，pH值1.0-A700nm，pH值1.0）-（A510nm，pH值4.5-A700nm，pH值4.5）

式中，A 為吸光值，ε 為消光系數(shù)26 900；L 為光程（1.0 cm）；MW 為矢車菊花素-3-葡萄糖苷的分子量（449.38）；DF 為稀釋因子；V 為待測樣品提取液的體積（mL）；M 為樣品質(zhì)量（g）。

1.2.3 單因素試驗對適宜提取條件的篩選 本試驗考察的提取條件因素有酸化乙醇中的乙醇濃度、乙醇與HCl 的體積比（V乙醇：VHCl）、提取時間、提取次數(shù)和提取溫度5 個。將其中的4 個因素固定，變化某個因素的水平，根據(jù)花色苷提取量確定單因素的適宜水平。

1.2.3.1 提取次數(shù)對提取液中花色苷含量的影響。在溶劑中乙醇濃度85%、V乙醇∶VHCl＝90∶10、提取溫度60 ℃、提取時間90 min 條件下，分別提取1、2 和3 次。

1.2.3.2 提取溫度對提取液中花色苷含量的影響。在溶劑中乙醇濃度85%、V乙醇∶VHCl＝90∶10、提取時間90 min 條件下，提取溫度分別設(shè)定為50、60、70、80和90 ℃，提取1 次。

1.2.3.3 提取時間對提取液中花色苷含量的影響。在溶劑中乙醇濃度85%、V乙醇∶VHCl＝90 ∶10、提取溫度60 ℃條件下，提取時間分別設(shè)定為72、80、88、96、104 和112 min，提取1 次。

1.2.3.4 乙醇濃度對提取液中花色苷含量的影響。提取溶劑中的乙醇濃度分別設(shè)定為72%、80%、88%、96%和100%，在V乙醇∶VHCl＝90 ∶10、提取溫度60 ℃、提取時間90 min 條件下提取1 次。

1.2.3.5 V乙醇∶VHCl對提取液中花色苷含量的影響。在溶劑中乙醇濃度85%、提取溫度60 ℃、提取時間90 min條件下，V乙醇∶VHCl分別設(shè)定為75∶25、80 ∶20、85∶15、90 ∶10、95∶5，提取1 次。

1.2.4 響應(yīng)面試驗對提取條件的優(yōu)化 根據(jù)單因素試驗結(jié)果選取合適的3 個因素，利用Design Expert 8.0 軟件采取Box-Behnken 試驗設(shè)計，通過三因素三水平的響應(yīng)面分析法對花色苷提取條件進行優(yōu)化。

2 結(jié)果與分析

2.1 花色苷提取工藝的單因素試驗結(jié)果

2.1.1 提取次數(shù)的選擇 隨著提取次數(shù)的增加，花色苷提取量呈逐漸增加趨勢，其中提取3 次處理的花色苷提取量分別較提取2 次、提取1 次處理提高了7.89%和13.10%，提取2 次處理的花色苷含量較提取1 次處理僅提高了4.83%，增幅均較小（圖1）。從經(jīng)濟和環(huán)保角度考慮，確定適宜的提取次數(shù)為1 次。

2.1.2 提取溫度的選擇 隨著提取溫度的升高，花色苷提取量呈先增加后降低的趨勢變化，其中提取溫度為60 ℃時指標(biāo)值最大，為1.85 mg/L（圖2）。提取溫度為50 ℃時花色苷提取量最低，溫度升高后花色苷提取量迅速增加，與升溫后花色苷擴散到提取溶劑中的速度加快有關(guān)；溫度達到一定程度后繼續(xù)升高時提取量逐漸下降，與溫度過高造成花色苷降解[21]有關(guān)。因此，確定適宜的提取溫度為60 ℃。

2.1.3 提取時間的選擇 隨著提取時間的延長，花色苷提取量呈先增加后降低的趨勢變化，其中提取時間為90 min 時指標(biāo)值最大，為1.87 mg/L（圖3）。因此，確定適宜的提取時間為90 min。

2.1.4 乙醇濃度的選擇 隨著乙醇濃度的增大，花色苷提取量呈先增加后降低的趨勢變化，其中乙醇濃度為80%時指標(biāo)值最大，為1.92 mg/L（圖4）。乙醇濃度較低時，溶液體系極性較差，影響花色苷的溶出，造成花色苷提取量低；乙醇濃度增大后有利于花色苷的溶出，花色苷提取量逐漸提高；但是乙醇濃度過大時桑葚粉中的其他雜質(zhì)也會溶出，影響花色苷含量的測定，導(dǎo)致花色苷提取量有所下降[22]。因此，確定適宜的乙醇濃度為80%。

2.1.5 V乙醇：VHCl的選擇 隨著V乙醇∶VHCl的增大，花色苷提取量呈先增加后降低的趨勢變化，其中V乙醇∶VHCl為85∶15 時指標(biāo)值最大，為1.97 mg/L（圖5）。因此，確定適宜的V乙醇∶VHCl為85∶15。

2.2 花色苷提取工藝的響應(yīng)面法優(yōu)化結(jié)果

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，V乙醇∶VHCl、提取溫度、乙醇濃度對花色苷提取量影響較大，因此選擇這3 個因素進行響應(yīng)面試驗設(shè)計（表2）。

表2 響應(yīng)面分析的因素及其水平編碼Table 2 Factors and their level codes by response surface analysis

2.2.1 響應(yīng)面法試驗設(shè)計與結(jié)果 利用Design Expert 8.0 軟件對不同因素與水平組合的試驗結(jié)果（表3） 進行分析，得到花色苷含量（Y）對自變量A（V乙醇：VHCl）、B（提取溫度） 和C（乙醇濃度） 的回歸方程：

表3 Box-Behnken 試驗設(shè)計及其結(jié)果Table 3 Box-Behnken test design and results

Y=2.03+0.28A-0.097B+0.081C-0.056AB-0.032AC-0.12BC-0.25A2-0.46B2-0.25C2

2.2.2 方差分析 對得出的回歸方程進行方差分析，模型P＜0.01，相關(guān)性達到了極顯著水平（表4），說明選用的二次多項模型具有高度的顯著性。失擬項P（0.591 7） ＞0.01，相關(guān)性不顯著；模型的決定系數(shù)R2=0.980 1，說明提取率的實測值與預(yù)測值之間具有很好的擬合度。因此，該模型擬合效果較好，可以用此模型來分析和預(yù)測桑葚花色苷的提取工藝。

各因素對花色提取量的影響順序為A（V乙醇：VHCl）＞B（提取溫度） ＞C（乙醇濃度），其中V乙醇：VHCl對花色提取量的影響達到了極顯著水平（P＜0.01），提取溫度和乙醇濃度對花色苷提取量的影響達到了顯著水平（P＜0.05）。

表4 回歸方程的方差分析Table 4 Variance analysis of regression equation

2.2.3 各因素之間的交互作用 提取溫度、V乙醇：VHCl、乙醇濃度交互作用對響應(yīng)值的影響可以從響應(yīng)圖面直觀反映出來[21]。提取溫度與乙醇濃度的交互作用達到了顯著水平（圖6～8）。

2.2.4 回歸模型的驗證 通過該回歸方程，求得優(yōu)化后的最佳工藝參數(shù)為乙醇與HCl 體積比87.77 ∶12.23、提取溫度58.41 ℃、乙醇濃度85.815%。該條件下，花色苷的提取量為2.13 mg/g。

考慮到實際操作的簡便性，將優(yōu)化后的工藝條件修正為乙醇與HCl 體積比90 ∶10、提取溫度60 ℃、乙醇濃度85%，并在此條件下進行了驗證試驗。結(jié)果顯示，該條件下花色苷的提取含量為2.22 mg/g，與理論預(yù)測值（2.13 mg/L） 的相對誤差小于2%。因此，應(yīng)用響應(yīng)面分析方法優(yōu)化得到的工藝參數(shù)結(jié)果可靠。

2.3 不同種植條件桑葚花色苷含量的比較

將多產(chǎn)地不同品種的桑葚凍干后，利用上述所得的最優(yōu)試驗條件進行花色苷提取。10 個參試桑葚品種的花色苷含量為1.035～1.973 mg/L，不同品種之間差異較大，其中產(chǎn)自衡水地區(qū)的黑珍珠花色苷含量最高（表5）。檢測結(jié)果為河北省桑葚產(chǎn)品研發(fā)以及花色苷的進一步利用提供了理論依據(jù)。

表5 桑葚中的花色苷含量（n=5，春季）Table 5 Anthocyanin content in mulberry (n=5，spring)

3 結(jié)論與討論

單因素試驗結(jié)果表明，提取液中酸化乙醇濃度、乙醇與HCl 體積比、提取溫度、提取時間和提取次數(shù)均對桑葚花色苷提取率有影響。響應(yīng)面回歸分析結(jié)果表明，提取過程中提取溫度與乙醇濃度的交互作用對花色苷提取率的影響最為顯著。采用響應(yīng)面法建立花色苷提取率的二次多項擬合方程，由模型優(yōu)化花色苷的提取條件為：提取液酸化乙醇中乙醇濃度85%，乙醇與HCl 體積比90 ∶10，提取溫度60 ℃，提取時間90 min，提取1 次。在此條件下，桑葚果花色苷提取量可達2.22 mg/L。對不同地區(qū)生長的桑葚花色苷含量進行了差異性分析，發(fā)現(xiàn)不同品種的花色苷含量差異較大，這為桑葚產(chǎn)品研發(fā)以及花色苷的進一步利用提供了理論依據(jù)。

桑葚保健功能已經(jīng)引起了人們的興趣，花色苷的功能顯著，桑葚為花色苷的重要來源之一，對高收率桑葚花色苷的提取工藝進行研究并提供指導(dǎo)，對桑葚花色苷類產(chǎn)品的分析及功能性食品和藥品的研發(fā)奠定了試驗基礎(chǔ)。