黃建溶 彭武建 陳燁

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)是一種以免疫性炎癥為最主要臨床表現(xiàn)的彌漫性結(jié)締組織,病因不明確,發(fā)病機(jī)制復(fù)雜。本研究采用Hiseq-2500 測序SLE 患者及健康者外周血單個(gè)核細(xì)胞micro RNAs,并進(jìn)行生物信息學(xué)分析,為SLE 的早期診斷與治療尋找新的線索。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017～2018 年本院及深圳市第三人民醫(yī)院收治的20 例SLE 患者作為SLE 組,均符合美國風(fēng)濕病協(xié)會1997 年修訂的SLE 診斷標(biāo)準(zhǔn)［1］,采用SLE 疾病活動度(SLEDAI)評分評估疾病活動度,均≥5 分,患者平均年齡(37.25±9.70)歲。選取同期20 例健康體檢者作為對照組,平均年齡(37.90±9.56)歲。兩組一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。該研究計(jì)劃經(jīng)本院倫理會批準(zhǔn),所有研究對象均對本研究知情。

1.2 總RNA 的提取、構(gòu)建文庫以及測序 抽取受試者外周抗凝血10 ml,于采血后1 h 使用淋巴細(xì)胞分離液分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs),加入Trizol 裂解,提取總RNA 用于小 RNA 建庫。樣品檢測合格后,使用Small RNA Sample Pre Kit 構(gòu)建文庫。運(yùn)用Illumina Hiseq-2500 高通量測序平臺測序。高通量測序在北京諾禾致源公司協(xié)助下完成。

1.3 測序的初步分析 測序所得小RNA 序列經(jīng)過去污染、去低質(zhì)量、去接頭一系列過程,獲得長度區(qū)間為18～35 nt 干凈小RNA 序列,用bowtie 將長度篩選后的sRNA 定位到參考序列上,分析small RNA 在參考序列上的分布情況。將上述mapped 到參考序列上的reads 與miRBase 中指定范圍序列進(jìn)行比對,得到各樣品匹配上的sRNA 的詳細(xì)情況,包括匹配上的已知miRNA 的二級結(jié)構(gòu),各樣本中miRNA 的序列、長度、出現(xiàn)的次數(shù)等信息。

1.4 microRNAs 表達(dá)及差異分析 對各樣本中microRNAs行表達(dá)量的統(tǒng)計(jì),并用TPM 進(jìn)行表達(dá)量歸一化處理。microRNAs 在兩組樣本間的倍比值≥2 且P<0.05,則認(rèn)為該microRNAs 在兩組樣本間的表達(dá)差異顯著。

1.5 生物信息學(xué)分析 對每組差異性表達(dá)microRNAs的靶基因的集合分別進(jìn)行GO 和KEGG 富集分析。

2 結(jié)果

2.1 兩組差異性表達(dá)microRNAs 用火山圖可以推斷差異microRNAs 的整體分布情況,對差異miRNA 進(jìn)行篩選,結(jié)果見圖1。SLE 組與對照組比較,表達(dá)有差異microRNAs 共有282 種,其中表達(dá)上調(diào)的有 206 種,表達(dá)下調(diào)的有76 種。表達(dá)上調(diào)及下調(diào)顯著差異的10 例microRNAs 見表1。

2.2 差異性表達(dá)microRNAs 靶基因GO 分析 GO富集主要生物學(xué)過程、細(xì)胞組成、分子功能3 種分類。生物學(xué)過程靶基因主要富集在cellular component organization or biogenesis 條目中。細(xì)胞組成主要富集在cytoplasm 中。分子功能主要富集在binding 中。顯著富集的各個(gè)GO term 中的基因數(shù)見圖2。

2.3 差異性表達(dá)microRNAs 靶基因KEGG 分析 差異性表達(dá)microRNAs 靶基因共有20 條顯著性KEGG信號通路,主要包括Pathways in cancer、PPAR signaling pathway 等信號通路。靶基因KEGG 富集散點(diǎn)圖見3。PPAR signaling pathway 信號通路圖見圖4。

圖1 顯著差異性表達(dá)microRNAs 分析火山圖

表1 SLE 組與正常對照組差異性表達(dá)的microRNAs

圖2 差異性表達(dá)microRNAs 靶基因的GO 富集分類

圖3 差異性表達(dá)microRNAs 靶基因主要聚集的KEGG 通路散點(diǎn)圖

圖4 PPAR 信號通路的KEGG 通路信號圖

3 討論

本研究采用Illumina Hiseq-2500 測序技術(shù)研究系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血單個(gè)核細(xì)胞microRNAs 與正常對照組差異性表達(dá)microRNAs,表達(dá)上調(diào)的有206 種,表達(dá)下調(diào)的有76 種。有研究表明miR-127 是影響女性乳腺癌預(yù)后的獨(dú)立因素,miR-127 高表達(dá)可以抑制乳腺癌腫瘤細(xì)胞的生長及減少其遷移轉(zhuǎn)移［2］,研究表明SLE 患者中乳腺癌的發(fā)病率低［3］。miR-4732-5P 在乳腺癌患者中高表達(dá),可以促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增值、遷移和侵襲［4］,本研究miR-4732-5P 在乳腺癌患者中低表達(dá)。Wen 等［5］研究表明miR-889-3p 上調(diào)與結(jié)核病患者CD1c 呈負(fù)相關(guān),而CD1c 在抗結(jié)核免疫中發(fā)揮重要作用,而SLE 患者是結(jié)核病的高發(fā)人群［6］。

KEGG 通路分析結(jié)果提示靶基因主要聚集Pathways in cancer、PPAR signaling pathway 等信號通路。Oxer DS 等研究發(fā)現(xiàn)PPARγ 可激活CD40,為促炎信號,在活動性的SLE 患者中高表達(dá)［7］。

綜上所述,SLE 的發(fā)生發(fā)展機(jī)制十分復(fù)雜,microRNAs 研究可以作研究SLE 發(fā)病機(jī)制、尋找特性生物學(xué)標(biāo)志物重要手段之一。