張秋妍，關(guān) 萍，陳新茹，屈長青

(1.阜陽師范大學 生物與食品工程學院，安徽 阜陽 236037；2.抗衰老中草藥安徽省工程技術(shù)研究中心，安徽 阜陽 236037)

芍藥、金銀花等五種中草藥皆具有清熱鎮(zhèn)痛，抗菌消炎的藥理作用，常用于制作清熱解毒的藥物和食品。金銀花(LonicerajaponicaThunb.)提取物以綠原酸和異綠原酸為主，這些有效物質(zhì)在抗菌消炎、解暑解熱、降脂降壓等方面有極好的藥理作用[1，2]。甘草(GlycyrrhizauralensisFisch.)提取物以甘草酸居多，甘草次酸是甘草酸的水解產(chǎn)物，甘草有止咳利咽、清熱解毒等作用[3，4]。夏枯草(PrunellavulgarisL.)提取物的主要成分是三萜皂甙，具有清肝、明目、消腫、止痛的作用[5，6]。菊花(Dendranthemamorifolium(Ramat.)Tzvel.)性味甘苦、涼、無毒，其有效成分為菊花黃酮，功效具有清熱解毒、清肝明目、治療頭痛眩暈、心胸煩悶等作用[7，8]。芍藥(PaeonialactifloraPall.)味苦酸，性微寒，歸肝、脾經(jīng)，具有抗炎、解熱鎮(zhèn)痛、抗菌、抗氧化、抗癌、抗自身免疫疾病、抗心腦血管疾病等作用[9]，芍藥苷為一種單萜類糖苷化合物，是芍藥的主要有效成分，藥用價值很高[10]。

秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans.)是一種新型模式生物，具有結(jié)構(gòu)簡單、發(fā)育周期短、遺傳信息明確、能感知氣味及味道、對光線和溫度有反應等生理特點等優(yōu)點[11，12]。本實驗用幾種不同濃度的清熱解毒中草藥對秀麗隱桿線蟲進行處理，檢測35℃熱應激下線蟲的運動能力。五種常見中藥材的解熱功能以及線蟲的優(yōu)勢特點都使實驗的研究具有了一定的研究意義，為開發(fā)對人體更加有利的保健產(chǎn)品提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans，C.elegans)作為研究對象，由阜陽師范大學抗衰老中草藥安徽省工程技術(shù)研究中心提供。大腸桿菌E.coliOP50作為秀麗隱桿線蟲的食物，由阜陽師范學院抗衰老中草藥安徽省工程技術(shù)研究中心提供。

1.1.2 試劑

蛋白胨，瓊脂，酵母提取物，乙醇，NaCl，M9緩沖液，裂解液，NGM固體培養(yǎng)基，LB液體培養(yǎng)基

LB固體培養(yǎng)基[13]：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，瓊脂15 g/L，加水溶解，用NaOH 調(diào)節(jié)pH至7.4，并定容至1 000 mL，高壓滅菌。

M9緩沖液[14]：每升緩沖液中含6 g Na2HPO4，3 g KH2PO4，5 g NaCl，0.25 g MgSO4·7H2O

NGM培養(yǎng)基的配制[15]：NaCl 0.3 g，蛋白胨0.25 g，瓊脂1.7 g，1 mol/L KH2PO4-K2HPO4緩沖液(pH6.0)2.5 mL，加水定容至100 mL，高壓121 ℃滅菌30 min滅菌后，待培養(yǎng)液降溫至60 ℃，加入膽固醇乙醇溶液(5 mg/mL)0.1 mL，1 mol/L MgSO40.1 mL，1 mol/L CaCl20.1 mL，快速混勻。

1.1.3 提取物的制備[16-17]

將五種中草藥80 ℃烘干，粉碎，20目篩出備用。取粗粉5 g，分別用70 %乙醇100 mL浸泡24 h，超聲提取2 h，過濾，取濾液 50 mL于沸水浴上蒸干，可得五種中草藥的粗提取物。

1.2 方法

1.2.1 不同濃度中草藥培養(yǎng)基的制備

分別稱取0.25 g的不同中草藥提取物，加入100 mL M9緩沖液，配制成2.5 mg/mL的藥品溶液，再分別稀釋成1.25 mg/mL、0.625 mg/mL、0.31 mg/mL三種濃度，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

每種中草藥各制備4組NGM固體培養(yǎng)基，分別加入不同濃度的提取液溶液，使得4組培養(yǎng)基中所含的芍藥苷溶液的最終濃度分別為0(空白對照組)，0.31mg/mL、0.625 mg/mL、1.25 mg/mL。

1.2.2 線蟲的培養(yǎng)

線蟲同步化處理后得L1幼蟲，將L1幼蟲接至含大腸桿菌OP50的NGM培養(yǎng)基中，20 ℃培養(yǎng)30 h，得L4蟲[18]。

1.2.3 熱應激處理線蟲[19]

將L4蟲分別轉(zhuǎn)接至含不同濃度中草藥的NGM培養(yǎng)基中，置于35 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在熱處理1 h，2 h，3 h后，每種濃度隨機選取50條線蟲進行測定。

1.2.4 線蟲運動能力的測定

頭部擺動頻率測定[20-22]：熱處理后的線蟲，經(jīng)過1 min恢復后，記錄線蟲在1 min內(nèi)頭部擺動的次數(shù)(當線蟲身體彎曲達到體長的一半時作為1次頭部擺動)，每組測定50條線蟲，重復3次。

身體彎曲頻率測定[20-22]：將熱處理后的線蟲放入未添加大腸桿菌OP50的NGM培養(yǎng)基上，記錄20s內(nèi)其身體彎曲的次數(shù)(假定沿著咽泵的方向為Y軸，線蟲爬行過程中身體沿著相應X軸方向上的1次改變作為1次身體彎曲)，每組測定50條線蟲，重復3次。

基本運動能力測定[20-22]：將熱處理后的線蟲記錄30 s內(nèi)其3種運動能力(向前、向后和 OmegaU擺動)的次數(shù)。向前擺動即線蟲向前類似正弦曲線的運動；向后擺動即逆向運動；OmegaU擺動即線蟲運動時頭部碰到尾部形成類似希臘字母Ω的形狀，此時身體彎曲角度通常大，重復3次。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用統(tǒng)計學的方法，對數(shù)據(jù)進行分析，文中所用的數(shù)據(jù)都是以(平均數(shù)±標準差)表示，采用SPSS 19.0對實驗組和對照組進行顯著性差異分析，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度的金銀花溶液對熱應激下線蟲運動能力的影響

如表1所示，經(jīng)金銀花溶液處理后的實驗組線蟲的運動能力較對照組相比均有提高，說明金銀花對熱應激下線蟲的運動能力均有保護作用，相比于0.31 mg/mL和0.625mg/mL的實驗組線蟲，溶液濃度為1.25 mg/mL的實驗組線蟲的運動能力極顯著高于空白組(P<0.01)。

2.2 不同濃度的甘草溶液對熱應激下線蟲運動能力的影響

如表2所示，經(jīng)甘草溶液處理后的實驗組線蟲的運動能力較對照組相比均有提高，其中溶液濃度為1.25 mg/mL的實驗組線蟲的運動能力明顯提高，說明甘草溶液對熱處理下的線蟲的運動能力有保護作用。

表1 不同金銀花濃度對L4期線蟲熱應激運動能力的影響

注：*表示與對照組相比，P<0.05，**表示與對照組相比P<0.01，下同。

表2 不同濃度的甘草溶液對L4期線蟲熱應激運動能力的影響

2.3 不同濃度的芍藥溶液對熱應激下線蟲運動能力的影響

如表3所示，經(jīng)芍藥溶液處理后的實驗組線蟲的運動能力較對照組相比均有明顯提高，其中溶液濃度為0.625 mg/mL的實驗組線蟲的運動能力提高最為明顯，說明芍藥溶液對熱應激下的線蟲的運動能力有保護作用。

表3 不同濃度芍藥溶液對L4期線蟲熱應激運動能力的影響

2.4 不同濃度的夏枯草溶液對熱應激下線蟲運動能力的影響

從表4可以看出，經(jīng)夏枯草溶液處理的實驗組線蟲運動能力與對照組相比均有明顯提高，相比于0.31 mg/mL和0.625 mg/mL的實驗組線蟲，濃度為1.25 mg/mL的夏枯草溶液對熱應激下的線蟲保護最為明顯，其運動能力極顯著高于空白組(P<0.01)。

表4 不同夏枯草濃度對L4期線蟲熱應激運動能力的影響

2.5 不同濃度菊花溶液對熱應激下線蟲運動能力的影響

從表5可得，經(jīng)菊花溶液處理的實驗組線蟲運動能力與對照組相比也有明顯提高，其中濃度為1.25 mg/mL的菊花溶液對熱應激下的線蟲保護最為明顯。

表5 不同菊花濃度溶液對L4期線蟲熱應激運動能力的影響

3 結(jié)論與討論

據(jù)文獻報道夏枯草、金銀花、芍藥等五種中草藥皆具有清熱解毒、鎮(zhèn)痛消炎的藥理作用[23-24]。目前有關(guān)這五種中藥抗炎抑菌，抗氧化方面等其他藥理作用的報道較多，林丹等研究發(fā)現(xiàn)金銀花的提取物對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌有較強的抑制作用[25]；芍藥的藥理研究多集中在免疫調(diào)節(jié)，保肝護肝等作用上[26]，Xiang等開展了芍藥總苷的臨床保肝作用研究，發(fā)現(xiàn)其能夠顯著降低由化學藥物引起的類風濕性關(guān)節(jié)炎病人的肝損傷[27]；夏枯草提取物的藥理作用研究主要集中在降壓降糖上，梁健欽等發(fā)現(xiàn)夏枯草提取物可能通過降低ET、AngⅡ含量和升高NO含量來發(fā)揮對SHIR 大鼠的降壓作用[28]；有關(guān)菊花和甘草提取物的研究也主要集中在抗菌抗氧化方面[29-30]；但目前有關(guān)這些中草藥解熱消暑方面的藥理作用及作用機制的研究較少，本文以秀麗隱桿線蟲作為研究對象，研究熱應激下中草藥對線蟲運動能力的保護作用，通過熱應激下運動能力的增強說明這五種中草藥皆具有提高機體耐熱性的作用。

本實驗利用秀麗隱桿線蟲為模式生物，研究五種中草藥對熱應激下對線蟲運動能力的保護作用，結(jié)果顯示這五種中草藥均對35 ℃熱應激后的線蟲的運動能力有影響，并對秀麗隱桿線蟲均有保護作用，其中1.25 mg/mL的夏枯草提取物、金銀花提取物、甘草提取物以及菊花提取物和0.625 mg/mL的芍藥提取物對熱應激下的線蟲保護作用較強。

綜合以上結(jié)果可知，這五種中草藥對秀麗隱桿線蟲熱應激具有一定保護作用，由此推測這些中草藥對提高人體耐熱能力有一定促進作用，其具體作用機理需要進一步研究深入，同時也為研發(fā)抗熱解暑類保健產(chǎn)品提供一定的理論基礎。