鮑艷霞，王 鳳，肖 倩，葛津瑞

（鎮(zhèn)江市高等?？茖W校，江蘇鎮(zhèn)江 212003）

在全民健康的今天，膽固醇是個經(jīng)久不衰的話題，它可調(diào)節(jié)腸胃消化道中膳食脂肪的吸收，具有重要的生理功能，但如果攝入量過多，可形成高血脂癥，引起動脈粥樣硬化，進而誘發(fā)冠心病、高血壓等一系列心腦血管疾病。雞蛋是老百姓生活不可缺少的食材，雞蛋中的膽固醇可能更易導致人體血清膽固醇水平的提高。因此，在養(yǎng)生健康主題的今天，雞蛋中膽固醇含量測定的方法及準確性是評定其營養(yǎng)價值的重要參數(shù)。

目前有多種測量膽固醇的方法，如比色法[1]、高效液相色譜法[2]等，其中比色法出現(xiàn)較早、應用較廣，是一種經(jīng)典方法，主要用于食品中膽固醇的測定，在測定一些食品如雞蛋中膽固醇時往往需要先進行預處理，探討了用比色法測定雞蛋膽固醇含量相關處理條件對測定的影響。

1 材料與試劑

雞蛋，市售食品級；膽固醇溶液（標準準備液）、鐵礬顯色液、氫氧化鉀、無水乙醇、石油醚、甲醇，均為分析純；實驗室常用設備、分光光度計、電熱恒溫水浴。

測定樣品膽固醇：根據(jù)不同樣品中膽固醇的含量決定取樣量。準備容量為25 mL的試管，將所稱取的樣本加入其中。準備無水乙醇4 mL，加入到上述試管當中。準備氫氧化鉀，質(zhì)量分數(shù)要求為50%，容量要求為0.5 mL，同樣加入到試管當中，充分進行反應。恒溫水浴進行皂化，溫度 65℃，時間1 h。在此過程中要定時振搖，間隔20～30 min，直到完全，取出后冷卻。準備5%氯化鈉，容量要求為3 mL，加入到冷卻的試管中；準備石油醚，容量要求為10 mL，同樣加入到上述試管當中，蓋緊玻璃塞，振搖，時間要求為2 min。完成后靜置，超過1 h，直至分層[3]。

上層為石油醚，將其取出放置在比色管內(nèi)，后者要求容量為10 mL，進行溫水浴，溫度65℃，同時用氮氣吹干。準備冰乙酸4 mL，加入到比色管內(nèi)；準備鐵礬顯色液2 mL，同樣加入到比色管內(nèi)，搖勻，靜置，時間15 min，于波長460～640 nm處比色。

將3 g蛋黃溶液準確放入25 mL比色管中，溶于蒸餾水中并搖勻。

2 試驗方法

2.1 標準曲線繪制[4]

準備膽固醇溶液，質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL，將甲醇加入其中，稀釋形成膽固醇標準溶液，此時質(zhì)量濃度為 0.10 mg/mL。分別吸取 0，0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL（即膽固醇 0，50.0，100.0， 200.0，300.0，400.0，500.0 μg） 至 25 mL 比色管中，用2 mL甲醇稀釋，然后沿壁緩慢加入2 mL硫磷鐵顯色劑，迅速搖勻，冷卻至室溫，加水稀釋至25 mL[5-6]。準備甲醇組做空白試驗，于波長550 nm處測定吸光度，獲得相應數(shù)值，繪制標準曲線。

2.2 顯色劑用量試驗

稱取3 g蛋黃液，根據(jù)上述操作步驟在60℃水浴中皂化1 h，按1∶10的料液比加入石油醚提取1 h，提取液在60℃下?lián)]干，殘液加入2 mL甲醇溶液1.0，1.5，2.0，2.5硫磷顯色劑，沿管壁加入，立即搖勻，保證足夠熱量，溫度超過80℃，確保顯色完全[7-8]。冷卻至室溫后，于波長550 nm處使用分光光度計比色法測定溶劑空白。確定顯色劑的用量[9]。

2.3 樣品處理條件試驗

2.3.1 料液比的影響

稱取3 g蛋黃液，根據(jù)上述操作步驟在60℃水浴中1 h皂化，分別根據(jù)料液比1∶6，1∶8，1∶10，1∶12，1∶14依次加入石油醚，于30℃下水浴提取1 h，提取液在60℃下?lián)]發(fā)干燥后測定，計算膽固醇的含量，確定最佳料液比。

2.3.2 提取溫度的影響

在60℃的水浴中1 h皂化后準確稱取3 g蛋黃液。在25℃下加入10 mL石油醚，分別在35，45，55℃水浴中提取1 h，提取液于60℃條件下?lián)]發(fā)干燥并測定，計算出膽固醇的含量，確定最佳提取溫度。

2.3.3 提取時間的影響

在60℃水浴中1 h皂化后準確稱取3 g蛋黃液，用10 mL石油醚在30℃水浴中提取0.5，1.0，1.5，2.0 h，于60℃條件下?lián)]發(fā)干燥測定提取物，計算甾醇的含量，確定最佳提取時間。

2.3.4 干燥溫度的影響

3 g蛋黃溶液是于60℃水浴中1 h皂化后精確稱取，通過加入1∶10石油醚提取1 h。提取溶液于50，55，60，70℃處測定，計算膽固醇含量，確定最佳擺桿的溫度。

2.4 精密度試驗

準備1～2個雞蛋，要求為同一品種，隨機選擇，打開取出蛋黃，制成勻漿。根據(jù)上述程序開展5個平行試驗，定時測量膽固醇含量，使用分光光度計，每次間隔5 min分析最終結(jié)果。

2.5 進行相同的對比試驗

獲得6個蛋黃漿樣品，根據(jù)上述操作步驟中提取膽固醇的方法，計算各提取物的吸光度，膽固醇含量的定量檢測，重復性試驗和RSD的計算。

2.6 回收率測試

使用0.15 g蛋黃溶液測定膽固醇含量，平行5次，加入2.5 mL膽固醇標準溶液。根據(jù)上述操作步驟測量膽固醇含量并計算RSD的回收率。

3 結(jié)果與分析

3.1 吸收曲線的繪制

吸取2 mL膽固醇標準液，操作和試驗方法將于不同波長460～640 nm處以甲醇溶液與硫磷鐵顯示劑測定吸光度，結(jié)果表明膽固醇于波長550 nm處的最大吸收，所以試驗使用550 nm波長。

3.2 顯色劑用量試驗

吸收曲線見圖1，顯色劑用量與吸光度的關系見圖2。

可見，顯色劑用量在2.0～3.5 mL內(nèi)測定結(jié)果變化不大，取2.0 mL為最佳，因此試驗選擇顯色劑用量取2.0 mL。

3.3 提取條件

3.3.1 料液比的影響

料液比1∶6，1∶8，1∶10，1∶12使用相同的方法提取和測定雞蛋中的膽固醇含量。

膽固醇含量與料液比關系的吸收曲線見圖4。

由圖4可知，料液比與膽固醇提取溶劑的量呈正比。當材料以10 mL的比例增加時，增加溶劑用量對提取膽固醇的影響并不大，可以減少溶劑的使用。

3.3.2 提取時間的影響

膽固醇含量與提取時間的關系見圖5。

在0.5，1.0，1.5 h后提取卵漿后，從圖5可以看出膽固醇含量的變化。在0.5 h內(nèi)，提取的膽固醇與提取時間呈正比。1 h膽固醇的提取率為2 h的提取率的103%，證明了提取時間為1 h時膽固醇的提取過程基本完成。為了減少試驗誤差的提取，提取時間應該是1 h。

3.3.3 提取溫度的影響

膽固醇含量與提取溫度的關系見圖6。

由圖6可知，提取溫度分別在25，35，45，55℃，提取時間為1 h時測定蛋漿的膽固醇含量。隨著溫度的升高，膽固醇的提取率先增加然后下降，并在35℃時達到最大值。

3.3.4 揮干溫度的影響

將膽固醇提取液分別于50，55，60，65，70℃條件下?lián)]干后，測得膽固醇含量。

膽固醇含量與揮干溫度關系的吸收曲線見圖7。

以60℃為界，低于這一溫度時，溫度與膽固醇提取率呈正相關，高于這一溫度時二者呈負相關，60℃時，采用這一溫度進行試驗。

3.4 精密度試驗

隨機抽取同一品種1～2個雞蛋打破并分離蛋清，得到蛋黃液勻漿，同法操作平行測定6次。

精密度與重復性試驗結(jié)果見表1。

3.5 重復性試驗

表1 精密度與重復性試驗結(jié)果

準確稱取6 g的蛋黃液勻漿樣品，根據(jù)上述步驟提取膽固醇的方法，結(jié)果列于表1中。由表1可知，6次平行試驗中每個蛋黃的平均膽固醇含量為1 613 mg，相對標準偏差為2.09%，這證明試驗重現(xiàn)性高。

3.6 加標回收率試驗

準備已測定膽固醇含量蛋黃液，對其進行測量，共5份，進行回收試驗[10]。測得平均回收率為95.41%，RSD為3.77%。

加標回收試驗數(shù)據(jù)見表2。

表2 加標回收試驗數(shù)據(jù)

3.7 樣品測定

在料液比1∶10，提取時間1 h，提取溫度35℃，蒸發(fā)溫度65℃下提取后分別對白殼、綠殼雞蛋進行測定。

樣品測定結(jié)果見表3。

由表3可知，綠殼的雞蛋與白殼的雞蛋中所含膽固醇含量相似。

表3 樣品測定結(jié)果

4 結(jié)論

蛋黃中膽固醇的最佳提取條件為料液比1∶10，提取時間1 h，提取溫度35℃，蒸發(fā)溫度65℃，每蛋黃中膽固醇含量為1 592 mg。該方法的優(yōu)點是操作簡單、設備要求不高、精度高[11]。因此，測量蛋黃膽固醇含量的方法快速有效。