汪海濱， 唐雪娟， 李浩洋

（1.中山市第一中等職業(yè)技術(shù)學(xué)校，廣東中山 528400；2.中山海關(guān)技術(shù)中心，廣東中山 528400）

汞在自然界中主要以無機(jī)汞和有機(jī)汞等形式存在，有機(jī)汞的毒性強(qiáng)于無機(jī)汞，其中甲基汞是毒性最強(qiáng)的有機(jī)汞，乙基汞的毒性次之。甲基汞和乙基汞均具有親脂性、生物累積性和生物放大效應(yīng)，可通過食物鏈遷移危害人體健康，尤其是甲基汞對中樞神經(jīng)系統(tǒng)易造成不可逆的傷害 （張?zhí)m等，2009）。因此，自日本水俁病事件發(fā)生后，有機(jī)汞造成的食源性危害引起了世界的廣泛關(guān)注（Elinal等，2007）。飼料是動(dòng)物養(yǎng)殖過程中獲取營養(yǎng)元素的主要來源，其所含有的有機(jī)汞能在動(dòng)物體內(nèi)富集進(jìn)而威脅人們身體健康（陳巖等，2016；丁紅梅等，2013）。因此，對飼料中有機(jī)汞檢測方法的研究具有重要意義。

目前，比較成熟的甲基汞和乙基汞分析方法主要為液相色譜-原子熒光光譜法 （LC-AFS）（李浩洋等，2019；孫蕾等，2018）、液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法 （LC-ICP-MS）（熊文明等，2013；張?zhí)m等，2009）和氣相色譜-原子熒光光譜法 （GC-AFS）（蘇榮等，2017； 崔穎等，2016） 等。LC-AFS可以達(dá)到很好的分離效果，但由于流動(dòng)相的稀釋，其檢出限相對較高，而LC-ICP-MS價(jià)格昂貴，限制了其在日常檢測中的應(yīng)用（顧昱曉，2013）。GC-AFS易與吹掃捕集方法聯(lián)用，具有較強(qiáng)的分離能力和更好的靈敏度（崔穎等，2016）。全自動(dòng)烷基汞分析儀將吹掃捕集模塊、氣相色譜模塊和原子熒光光譜模塊有效整合，具有靈敏度高、準(zhǔn)確性好、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)（唐麗嶸等，2017）。因此，本研究擬建立全自動(dòng)烷基汞分析儀測定飼料中甲基汞和乙基汞的方法，以期為飼料的檢驗(yàn)監(jiān)管提供強(qiáng)有力的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器 甲基汞標(biāo)準(zhǔn)品 [（69.5±2.6）μg/g，中國計(jì)量科學(xué)研究院]；乙基汞標(biāo)準(zhǔn)品[（70.6±2.5）μg/g， 中國計(jì)量科學(xué)研究院]；ERM-CE464 金槍魚標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) （Joint Research Centre，European Reference Materials）；甲醇（色譜純）、氫氧化鉀、鹽酸（優(yōu)級(jí)純）；實(shí)驗(yàn)用水為超純水；醋酸鈉緩沖溶液（pH≈5.8）：稱取27.2 g三水合醋酸鈉溶于80 mL超純水中，加入1.0 mL醋酸，用超純水定容至100 mL；衍生試劑：將 100 mL 2%（m/V）氫氧化鉀溶液置于0℃冰箱中凍至出現(xiàn)冰晶，加入1.0 g四丙基硼化鈉粉末，混勻后分裝到色譜樣品瓶中，冷凍備用；飼料樣品為市售。

MERX-M型全自動(dòng)烷基汞分析儀 （美國Brooks Rand公司）；DKN612C型烘箱 （日本YAMATO公司）。

1.2 儀器工作條件 原子熒光檢測器電壓為670 V，氣相色譜柱為OV-3填充柱 （340 mm×1.59 mm），溫度為41℃，吹掃捕集氣為氮?dú)?，氮?dú)饬魉贋?44 mL/min，吹掃捕集時(shí)間為9 min，Tenex管解析加熱時(shí)間為9.9 s，捕集管干燥時(shí)間為5 min，干燥氣為氮?dú)猓稍餁饬魉贋?33 mL/min，氣相色譜載氣為氬氣，氬氣流速為27.5 mL/min。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制 采用稱量法，用去離子水配制甲基汞和乙基汞混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，其中甲基汞和乙基汞的濃度均為100 pg/mL。在經(jīng)過高溫凈化的40 mL棕色進(jìn)樣瓶內(nèi)提前加入34~38 mL去離子水， 然后分別加入 0.10、0.50、1.00、2.50、5.00 mL混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，再加入0.5 mL醋酸鈉緩沖溶液和50μL衍生試劑，進(jìn)行衍生化反應(yīng)，最后加超純水至40 mL，顛倒混勻，待測；此時(shí)，棕色進(jìn)樣瓶內(nèi)分別含有 10、50、100、250、500 pg 甲基汞和乙基汞。

1.4 金槍魚對照品制備 在ERM-CE464金槍魚標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中添加一定量的乙基汞標(biāo)準(zhǔn)品，得到金槍魚對照品，其中甲基汞的參考值為 （5.50±0.17）mg/kg，乙基汞的參考值為 2.00 mg/kg。

1.5 樣品前處理 準(zhǔn)確稱量0.2 g（精確到0.0001 g）飼料樣品至高速離心管中，加10 mL 25%氫氧化鉀/甲醇溶液，在烘箱中60℃加熱5 h，然后以3000 r/min離心15 min。同時(shí)做試劑空白。提取過程中，每隔2 h用渦旋振蕩儀渦旋一次，使提取液與樣品充分接觸。在經(jīng)過高溫凈化的40 mL棕色進(jìn)樣瓶內(nèi)提前加入36～38 mL超純水，然后加入0.1 mL處理好的空白溶液或樣品溶液，用10%HCl調(diào)節(jié)pH到6～8后，再加入0.5 mL醋酸鈉緩沖溶液和50μL衍生試劑，進(jìn)行衍生化反應(yīng)，最后加超純水至40 mL，顛倒混勻，得到空白上機(jī)溶液和樣品上機(jī)溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取方法的優(yōu)化 目前，有機(jī)汞的提取方式主要有酸法和堿法，其中酸法常與超聲或微波輔助技術(shù)相結(jié)合（孫蕾等，2018；熊文明等，2013），堿法則可以直接加熱進(jìn)行提?。ㄌK榮等，2017）。本研究分別采用鹽酸微波輔助提取、鹽酸超聲輔助提取和堿法直接加熱提取對飼料樣品進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果表明，酸法前處理后的部分樣品上機(jī)溶液在吹掃捕集過程中，無法通過氣液分離器完全分離，少許溶液被吹掃進(jìn)Tenax捕集管中，導(dǎo)致儀器無法運(yùn)行。因此，試驗(yàn)選擇 10%、15%、20%、25%、30%氫氧化鉀/甲醇溶液60℃加熱5 h，對飼料樣品和金槍魚對照品中的甲基汞和乙基汞進(jìn)行檢測，結(jié)果見表1。結(jié)果表明：低濃度的氫氧化鉀/甲醇溶液對飼料中甲基汞和乙基汞的提取效率較低，但隨著氫氧化鉀濃度的增加，飼料中甲基汞和乙基汞的檢測值也不斷升高，當(dāng)氫氧化鉀/甲醇溶液濃度超過25%后，飼料樣品中甲基汞和乙基汞的檢測值最高且無明顯變化，而金槍魚對照品的檢測值與參考值相符，這說明飼料中的甲基汞和乙基汞已被完全提取，且在提取過程中甲基汞和乙基汞的形態(tài)未發(fā)生轉(zhuǎn)化。因此，選擇25%氫氧化鉀/甲醇溶液60℃加熱5 h作為本研究的提取方法。

表1 提取液濃度對測定結(jié)果的影響

2.2 提取溫度的優(yōu)化 提取溫度會(huì)影響有機(jī)汞的回收率以及不同形態(tài)汞之間的轉(zhuǎn)化 （冷庚等，2012）。 本研究在不同提取溫度（40、50、60、70 ℃）下對飼料樣品和金槍魚對照品進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見表2。結(jié)果表明：隨著溫度的升高，飼料樣品中甲基汞和乙基汞的檢測值也隨之升高，當(dāng)提取溫度為60℃時(shí)，飼料樣品中甲基汞和乙基汞的檢測值達(dá)到最高，且金槍魚對照品的檢測值與參考值相符。而當(dāng)提取溫度為70℃，甲基汞和乙基汞的檢測值反而降低，這可能是因?yàn)榧状嫉姆悬c(diǎn)為64.7℃，當(dāng)溫度超過64.7℃后，樣品和金槍魚對照品中的甲基汞和乙基汞隨著甲醇的蒸發(fā)而逸出，導(dǎo)致檢測值偏低。由此可知，當(dāng)提取溫度為60℃時(shí)，飼料中的甲基汞和乙基汞已被完全提取，且在提取過程中甲基汞和乙基汞的形態(tài)未發(fā)生轉(zhuǎn)化。

表2 提取溫度對測定結(jié)果的影響

2.3 提取時(shí)間的優(yōu)化 本研究在不同提取時(shí)間（1、2、3、4、5、6 h）下對飼料樣品進(jìn)行試驗(yàn)。 試驗(yàn)結(jié)果表明：隨著提取時(shí)間的延長，飼料樣品中甲基汞和乙基汞的檢測值也隨之升高。當(dāng)提取時(shí)間超過5 h后，增加提取時(shí)間，甲基汞和乙基汞的測定結(jié)果均無明顯變化，故從節(jié)約時(shí)間的角度考慮，選擇提取時(shí)間為5 h（圖1）。

2.4 色譜條件的選擇 影響Hg0、甲基汞、乙基汞和Hg2+衍生化產(chǎn)物分離程度的主要因素有兩個(gè)：一是載氣流速，二是氣相色譜柱溫度。選擇載氣流速為27.5 mL/min，氣相色譜溫度為41℃作為本研究的色譜條件，在此色譜條件下，樣品溶液中Hg0（1）、甲基汞（2）、乙基汞（3）和 Hg2+（4）衍生化產(chǎn)物能實(shí)現(xiàn)完全分離，且甲基汞（2）、乙基汞（3）的峰形對稱（圖2）。

2.5 工作曲線和檢出限 將標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和空白上機(jī)溶液上機(jī)測定，分別以甲基汞和乙基汞衍生化產(chǎn)物的峰高響應(yīng)值對應(yīng)其含量繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，其中，甲基汞的曲線方程為：Y=237.75X+120.67，線性相關(guān)系數(shù)r=0.9996，方法檢出限為3 μg/kg，方法定量限為8μg/kg；乙基汞曲線方程為：Y=105.18X+152.08，線性相關(guān)系數(shù) r=0.999 6，方法檢出限為4μg/kg，方法定量限為13μg/kg，能夠滿足飼料中甲基汞和乙基汞的分析要求。250 pg標(biāo)準(zhǔn)工作溶液色譜圖見圖3。

2.6 方法精密度和回收率實(shí)驗(yàn) 平行稱取飼料樣品7份，進(jìn)行7次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）即為方法精密度，甲基汞和乙基汞的RSD分別為4.58%和5.19%。另平行稱取飼料樣品9份，分別進(jìn)行高、中、低3個(gè)濃度水平的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，甲基汞的平均回收率為91.1%～98.2%，乙基汞的平均回收率為88.5%～95.7%（表3）。

表3 方法精密度（n=7）和回收率實(shí)驗(yàn)（n=3）

2.7 樣品分析 應(yīng)用建立的方法對220批市售飼料樣品進(jìn)行檢測，包括魚飼料50批、蝦飼料20批、蟹飼料20批、飼料用紅魚粉20批、雞飼料50批、鴨飼料20批、豬飼料30批，其結(jié)果見表4。由表4可知，雞、鴨和豬飼料樣品中均未檢出甲基汞和乙基汞，而部分水產(chǎn)飼料樣品（魚、蝦、蟹飼料及飼料用紅魚粉）中檢出了甲基汞和乙基汞，但含量水平較低。

表4 樣品分析結(jié)果

3 結(jié)論

本試驗(yàn)建立了堿法提取-全自動(dòng)烷基汞分析儀測定飼料中甲基汞和乙基汞的方法，該法操作簡單，結(jié)果準(zhǔn)確，靈敏度高，適用于飼料中甲基汞和乙基汞的測定。