張慎聽

炎癥性腸病(IBD)是主要影響消化道功能的一種慢性非特異性炎性疾病，發(fā)病率逐年上升，主要類型有潰瘍性結(jié)腸炎(UC)和克羅恩病(CD)[1]。目前，IBD的病因尚不清楚，需要綜合臨床表現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)室和影像學(xué)檢查，內(nèi)窺鏡檢查和組織病理學(xué)檢查來進(jìn)行診斷[2]。近年來，IBD的實(shí)驗(yàn)室檢測取得了很大進(jìn)展，不僅可以用于輔助IBD的診斷，還有利于疾病的分層和預(yù)后評估，在IBD的臨床診斷和治療中發(fā)揮重要作用[3]。研究表明，鐵調(diào)素(Hepc)可能與IBD的發(fā)病機(jī)制和炎癥反應(yīng)有關(guān)，IBD引起的局部失血可降低體內(nèi)血漿血紅蛋白(Hb)水平；游離DNA是細(xì)胞外DNA，存在于體液如血液和腦脊液中，具有最小的游離DNA含量[4]。研究表明，游離DNA與各種疾病有關(guān)，如腫瘤、心肌梗死、創(chuàng)傷和系統(tǒng)性紅斑狼瘡等[5]。本次研究選取經(jīng)腸道鏡檢證實(shí)為IBD的患者120例，探討IBD患者血漿Hepc、Hb、游離DNA、CRP的變化及其臨床意義，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料：選取2016年1月-2018年8月我院經(jīng)腸道鏡檢證實(shí)為IBD的患者120例作為病例組，選取健康對象60例作為對照組。病例組患者年齡17～65歲，平均(44.6±12.1)歲；男68例，女52例；體質(zhì)量指數(shù)(BMI)(23.1±2.2)kg/m2，其中UC 70例(活動(dòng)期40例，緩解期30例)，CD50例(活動(dòng)期27例，緩解期23例)。對照組患者年齡19～65歲，平均(46.2±11.8)歲；男30例，女30例； BMI(23.3±2.1)kg/m2。2組研究對象的年齡、性別、BMI比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。診斷及入選標(biāo)準(zhǔn)：①炎性腸病的診斷標(biāo)準(zhǔn)參考《炎性腸病診斷與治療的共識(shí)意見(2012年廣州)》中的標(biāo)準(zhǔn)；②經(jīng)腸道鏡檢查、病理學(xué)活檢證實(shí)；③UC活動(dòng)期標(biāo)準(zhǔn)為Mayo評分≥2分，CD的活動(dòng)期判斷標(biāo)準(zhǔn)為炎性腸病活動(dòng)指數(shù)≥150分；④入組對象近3個(gè)月未接受相關(guān)治療措施；⑤本研究符合《赫爾透辛基宣言》相關(guān)醫(yī)學(xué)倫理規(guī)定，獲得研究對象的知情同意。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①惡性腫瘤；②腸道梗阻、穿孔；③嚴(yán)重出血、凝血功能障礙；④自身免疫性疾?。虎萜渌c道疾病。

1.2 指標(biāo)檢測方法:游離DNA的提取和檢測。抽取患者2 mL空腹靜脈血，加入抗凝劑，1 000 r/min離心5 min，分離血清，得到的血漿以6 000 r/min離心5 min，分離血漿并儲(chǔ)存在-80 ℃的冰箱中。使用血清/血漿核酸純化試劑盒，使用0.5 mL血漿提取游離DNA，并嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行操作，定容到100 μl的AVE緩沖液中。使用Quant-iTTM Pico Green dsDNA定量試劑盒，并仔細(xì)按照說明操作。取50 μl提取的游離DNA，加至黑色96孔微孔板，加入50 μl 200倍稀釋的Pico Green熒光染料，在室溫下孵育10 min，并使用Spectra Max i3熒光微板測定系統(tǒng)在480 nm的激發(fā)波長和520 nm的發(fā)射波長下測量熒光值。使用已知濃度為0～1 000μg/ L的Lambda DNA(Invitrogen，USA)作為標(biāo)準(zhǔn)品，計(jì)算樣品濃度。血漿Hb、CRP、Hepc水平檢測，所有患者在禁食后清晨抽取12 mL外周靜脈血，取3 mL血液檢測血漿Hb水平；再取6 mL進(jìn)行3 000 r / min離心10 min，離心半徑8.5 cm分離血清，之后通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測CRP和Hepc的水平。試劑盒購自上海浩然生物科技有限公司。

1.3 炎性腸病活動(dòng)指數(shù):IBD活動(dòng)性標(biāo)準(zhǔn):UC依據(jù)Mayo評分，包括腹瀉、便血、內(nèi)鏡下黏膜病變、醫(yī)師病情評估等，采用4級評分法(0～3分)，其中<2分為緩解期，≥2分為活動(dòng)期；CD依據(jù)CD活動(dòng)指數(shù)(CDAI評分),包括腹瀉、腹痛、一般情況、腸外表現(xiàn)、腹部包塊、貧血、體質(zhì)量等,采用人工計(jì)分法，總分258分，其中<15分為緩解期，≥150分為活動(dòng)期。

2 結(jié)果

2.1 病例組和對照組Hepc、Hb、游離DNA與血清CRP測定值比較:病例組Hepc、游離DNA與血清CRP高于對照組(P<0.05)；病例組Hb測定值低于對照組(P<0.05)，見表1。

表1 2組患者Hepc、Hb、游離DNA與血清CRP測定值的比較

2.2 UC組患者活動(dòng)期和緩解期Hepc、Hb、游離DNA與血清CRP測定值的比較：UC活動(dòng)期患者的Hepc、游離DNA與血清CRP高于UC緩解期患者(P<0.05)，Hb值低于UC緩解期患者(P<0.05)，見表2。

表2 UC組患者活動(dòng)期和緩解期Hepc、Hb、游離DNA與血清CRP值的比較

2.3 CD組患者活動(dòng)期與緩解期Hepc、Hb、游離DNA與血清CRP測定值的比較：CD活動(dòng)期患者的Hepc、游離DNA與血清CRP高于UC緩解期(P<0.05)，Hb值低于CD緩解期(P<0.05)，見表3。

表3 CD組患者活動(dòng)期和緩解期Hepc、Hb、游離DNA與血清CRP值的比較

2.4 UC、CD患者活動(dòng)期Hepc、Hb、游離DNA、血清CRP與活動(dòng)情況的相關(guān)性比較:UC、CD活動(dòng)期患者的Hepc、游離DNA與血清CRP分別與Mayo評分、CDAI評分呈顯著正相關(guān)性(P<0.05)，Hb值與Mayo評分、CDAI評分呈負(fù)相關(guān)性(P<0.05)，見表4。

表4 相關(guān)性分析結(jié)果

3 討論

免疫DNA技術(shù)定量檢測的快速發(fā)展促進(jìn)了游離DNA研究的擴(kuò)展，不僅腫瘤患者的游離DNA變化，而且自身免疫性疾病、炎癥性疾病、心肌梗死、創(chuàng)傷等患者的血液游離DNA也會(huì)變化。游離DNA作為一種非侵入性測試指標(biāo)，將成為一種新的生物標(biāo)志物用于早期診斷，療效判斷和療效監(jiān)測[4-6]。PicoGreen試劑是近年來使用的一種新型熒光染料，PicoGreen熒光比色法可以高靈敏度特異性地結(jié)合雙鏈DNA，與熒光定量PCR結(jié)果在測定游離DNA上具有高度一致性，是一種簡單、快速、高效的DNA定量檢測方法[7]。

游離DNA的產(chǎn)生機(jī)制尚不清楚，血漿中游離DNA的積累可能是由于大量細(xì)胞死亡，以及由炎癥反應(yīng)引起的DNA過度釋放，游離DNA可反映細(xì)胞損傷和炎性病變的程度[8]。不同疾病中游離DNA升高的機(jī)制是不同的，腫瘤是發(fā)生異常的凋亡，心肌梗死和創(chuàng)傷是機(jī)體發(fā)生大量細(xì)胞壞死或死細(xì)胞，系統(tǒng)性紅斑狼瘡和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病主要是由于游離DNA和其他蛋白質(zhì)結(jié)合的復(fù)合物清除過程受到阻礙，以及由炎癥反應(yīng)引起的DNA的過度釋放[9]。該研究結(jié)果表明，IBD患者的游離DNA含量高于健康對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?；顒?dòng)性CD和UC患者的游離DNA含量高于緩解期，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，含量的升高與IBD中腸炎癥反應(yīng)的發(fā)展和進(jìn)展相關(guān)，對游離DNA的檢測有助于識(shí)別活動(dòng)期的IBD。

CRP是目前IBD疾病活動(dòng)臨床評估的最常見指標(biāo)。血漿游離DNA含量與CRP和IBD活性呈正相關(guān)性，進(jìn)一步證明游離DNA可用作監(jiān)測IBD活性的指標(biāo)[10]。由于其他因素，CRP無法真實(shí)反映患者的疾病活動(dòng)，單一指標(biāo)對患者的診斷價(jià)值有限[11]。研究表明，IBD發(fā)病后會(huì)發(fā)生腸道出血并伴有不同程度的貧血，導(dǎo)致體內(nèi)Hb水平降低，提示Hb水平可能反映IBD的發(fā)生[12]。Hepc是一種小分子多肽，受體內(nèi)鐵負(fù)反饋調(diào)節(jié)，具有調(diào)節(jié)體內(nèi)鐵代謝的功能。當(dāng)人體缺鐵時(shí)，它可以抑制Hepc的產(chǎn)生，增加腸道鐵的吸收，促進(jìn)巨噬細(xì)胞的鐵和肝臟鐵元素的釋放。當(dāng)身體含鐵過量時(shí)，它可以刺激Hepc的形成，抑制腸道中鐵的吸收，避免鐵過載[13-15]。研究組Hepc高于對照組(P<0.05);病例組的Hb測量值低于對照組，活動(dòng)期CD和UC活動(dòng)期患者的Hepc高于緩解期，Hb測量值低于緩解期患者。表明患有腸黏膜免疫反應(yīng)的患者腸道菌群，感染或其他因素不能有效抑制T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等，導(dǎo)致免疫失衡，不僅損害胃腸黏膜，導(dǎo)致腸道失血，表現(xiàn)隨著Hb水平的降低，它將刺激Hepc的產(chǎn)生并增加腸道中鐵的吸收，促進(jìn)巨噬細(xì)胞中鐵和肝的釋放以補(bǔ)償缺鐵癥狀，并增加IL-6等炎癥介質(zhì)，與Hepc共同參與炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致鐵的吸收和利用障礙，患者的貧血等癥狀加重，導(dǎo)致IBD的發(fā)生。相關(guān)性顯示，UC、CD活動(dòng)期患者Hepc、游離DNA和血清CRP分別與Mayo評分、CDAI評分呈顯著正相關(guān)，Hb測定值與Mayo評分、CDAI評分呈負(fù)相關(guān)性。

綜上所述，與健康人群相比，IBD患者血漿Hepc、Hb、游離DNA與血清CRP變化顯著，并且與疾病活動(dòng)情況有一定的關(guān)系，檢測上述因子水平可能是評估患者病情的重要參考指標(biāo)。