孫卓成，馬生賢，田 榮，張 玲，李思睿，楊曉玲

中介素(IMD)是2004年新發(fā)現(xiàn)的血管活性多肽，屬于降鈣素基因相關肽超家族成員(CGRP)[1]，其前體蛋白在體內(nèi)可以酶解為IMD1-47、IMD8-47和IMD1-53等三個活性片段[2]。研究顯示，IMD1-53除了具有舒張血管[3]、降低血壓[4]等作用外，還能抑制泡沫細胞的形成[5]。miRNAs是20～25 nt的具有調(diào)控功能的非編碼RNA，在體內(nèi)參與了多個生物學過程，而miR-34a參與了動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展[6]。但是IMD1-53是否通過miR-34a抑制泡沫細胞的形成尚不清楚。本研究以泡沫細胞為研究對象，探討miR-34a在IMD1-53抑制泡沫細胞脂質(zhì)沉積中的作用，為臨床脂代謝紊亂相關疾病的研究提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料：IMD1-53購自鳳凰制藥公司，RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清購自Gibco公司，DNA 提取試劑盒購自碧云天生物科技公司、RNA 提取試劑盒購自天根生物有限公司，熒光定量PCR 試劑盒購自TaKaRa公司，DNA修飾試劑盒購自美國Zymo公司，TC和TG檢測試劑盒購自南京建成公司。引物由上海生工生物工程公司合成。

1.2 細胞培養(yǎng)：參考文獻方法培養(yǎng)THP-1細胞[7]，先用佛波酯(終濃度為100 nM)刺激24 h 使之分化為巨噬細胞，再用氧化低密度脂蛋白(終濃度50 mg/L)刺激24 h 使之變成泡沫細胞。將誘導成功的泡沫細胞隨機分為對照組、IMD1-53干預組(終濃度為1 μM)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，用于后續(xù)實驗。

1.3 熒光定量PCR檢測泡沫細胞miR-34的mRNA水平：用Trizol試劑按操作說明方法提取細胞總RNA，紫外分光光度計檢測總RNA的A260和A280。按照miRNA逆轉錄試劑盒說明書制備cDNA，首先向miRNA加Poly尾進行修飾，然后合成miRNA cDNA第一鏈。合成的cDNA用于下游PCR擴增條件：95 ℃ 5 min啟動，94 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s，70 ℃ 30 s進行40個循環(huán)。表達量用內(nèi)參U6進行校正，結果用2-△△CT法分析。

1.4 甲基化特異性PCR檢測miR-34a啟動子甲基化：按照試劑盒說明書提取細胞DNA，并對基因組DNA進行甲基化處理。由于DNA甲基化常發(fā)生于基因啟動子區(qū)CpG島中的胞嘧啶，因此，在UCSC(http://www.genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway)網(wǎng)站中尋找miR-34a基因啟動子區(qū)序列，使用甲基化引物設計軟件(htty://www.urogene.org/methprimer)設計miR-34a的引物，包括甲基化引物和未甲基化引物。序列如下：甲基化引物，上游：5’- GGGATTAGGTTTTGAACGC-3’，下游：5’-CCTAAAAACAAAAAACGCGT-3’；未甲基化引物，上游：5’-AAAGGGATTAGGTTTTGAATGT-3’，下游：5’-TCCTAAAAACAAAAAACACATAC-3’。擴增產(chǎn)物用DNA瓊脂糖凝膠電泳，凝膠掃描觀察分析結果。

1.5 細胞內(nèi)膽固醇含量測定：用刮刀刮取培養(yǎng)的細胞，制成細胞懸液，PBS洗滌3次，超聲裂解1 min，考馬斯亮藍G-250對樣品中的蛋白進行定量，1 000 r/min離心10 min，棄去上清液；收集細胞沉淀，超聲破碎細胞后在96孔板空白孔、校準孔、樣本孔中分別加入蒸餾水、校準品、樣本與工作液，酶標儀測定吸光度值，再用對應公式計算細胞內(nèi)膽固醇含量(TC)和甘油三酯含量(TG)。

2 結果

2.1 IMD1-53抑制泡沫細胞脂質(zhì)聚集：泡沫細胞經(jīng)IMD1-53處理后，泡沫細胞內(nèi)TC和TG的含量分別降低36.4%和37.8%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 IMD1-53對泡沫細胞內(nèi)TC和TG的影響

2.2 IMD1-53對泡沫細胞miR-34a mRNA和甲基化的影響：與正常對照組相比，IMD1-53組泡沫細胞內(nèi)miR-34a的表達減少了62.2%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。進一步用甲基化PCR檢測泡沫細胞啟動子區(qū)的甲基化水平，結果顯示與正常對照組相比，IMD1-53處理泡沫細胞后，miR-34a啟動子區(qū)甲基化水平升高了1.05倍，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 IMD1-53對泡沫細胞miR-34a mRNA和甲基化的影響

3 討論

動脈粥樣硬化斑塊中的泡沫細胞絕大部分來自于血液單核細胞，當發(fā)生炎癥時，單核細胞向炎癥部位浸潤并伸出偽足變成巨噬細胞，進一步吞噬ox-LDL以及過量的膽固醇生成脂滴，最終觸發(fā)泡沫細胞的形成[8]。因此，減少泡沫細胞內(nèi)脂質(zhì)沉積能夠延緩動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。

IMD又稱為腎上腺髓質(zhì)素2，是降鈣素相關基因肽超家族的新成員，具有擴張血管、降低血壓、穩(wěn)定血管內(nèi)皮屏障等作用，是一種強的內(nèi)源性的心血管保護因子，具有潛在的臨床應用前景[3-4]。本研究結果顯示，泡沫細胞用IMD1-53干預后，細胞內(nèi)膽固醇和甘油三酯水平明顯降低，表明IMD1-53能夠抑制泡沫細胞內(nèi)的脂質(zhì)沉積，與文獻報道一致[5]。但IMD1-53是通過哪些機制影響泡沫內(nèi)脂質(zhì)沉積尚不清楚。

miRNAs是一類由內(nèi)源性基因編碼的小分子非編碼RNA，可通過誘導mRNA的降解、翻譯抑制或其它形式抑制靶基因的表達，在調(diào)控生物體的生長、發(fā)育及分化等方面發(fā)揮重要作用。研究顯示，miR-34a在乳腺癌中主要作用為抑制癌細胞生長、增殖及遷移[9]，其還可與c-myc結合，降低c-myc的蛋白表達水平，從而抑制肺癌[10-11]。另外，miR-34a可通過調(diào)控靶基因Notch1參與乳腺癌細胞凋亡[12]。由此可見，miR-34a在許多疾病中發(fā)揮重要作用。另有研究報道，抑制miR-34a的表達，可減少心肌細胞凋亡[13-14]，因此，miR-34a可能是心血管疾病治療的重要靶點。本研究結果顯示，用IMD1-53處理泡沫細胞后，miR-34a表達降低，提示IMD1-53抑制泡沫細胞內(nèi)的脂質(zhì)沉積與下調(diào)miR-34a的表達有關。DNA甲基化是表觀遺傳學的重要內(nèi)容，能夠逆向調(diào)控基因的表達[15]，常常發(fā)生于基因啟動子區(qū)的CpG島[16]。我們用生物信息學分析了miR-34a啟動子區(qū)的甲基化情況，發(fā)現(xiàn)在其啟動子上游約350～580 bp附近有一個CpG島，提示miR-34a的表達可能受到甲基化調(diào)控。進一步用甲基化特異性PCR檢測miR-34a啟動子甲基化水平，發(fā)現(xiàn)IMD1-53干預泡沫細胞后，miR-34a啟動子區(qū)甲基化水平明顯增加，提示miR-34a啟動子高甲基化可能是IMD1-53延緩脂質(zhì)沉積的重要機制。

綜上所述，IMD1-53可抑制THP-1單核源性泡沫細胞miR-34a的表達，延緩泡沫細胞的形成，miR-34a啟動子區(qū)甲基化在IMD1-53延緩泡沫細胞脂質(zhì)形成中具有重要作用，但IMD1-53是如何影響miR-34a啟動子區(qū)甲基化的機制，還需要進一步探究。