王 浩，佟雪琪，朱明星，趙嘉慶，趙 巍

包蟲(chóng)病是一種寄生蟲(chóng)蚴蟲(chóng)感染人體或家畜而引發(fā)的嚴(yán)重危害人畜健康的慢性感染性疾病。該病分布廣泛，世界范圍內(nèi)多個(gè)地區(qū)與國(guó)家均有流行。在我國(guó)，目前已經(jīng)證實(shí)有25個(gè)省區(qū)存在感染病例，尤其在西部等畜牧業(yè)發(fā)達(dá)地區(qū)，人群患病率為0.6%～4.5%[1]。寧夏是我國(guó)包蟲(chóng)病發(fā)病最高的地區(qū)之一，有數(shù)據(jù)表明，寧夏川區(qū)和城市的陽(yáng)性率分別達(dá)到了7.9%和5.8%，南部山區(qū)包蟲(chóng)病血清陽(yáng)性感染率為10.6%，B超篩查發(fā)現(xiàn)寧夏西吉縣中學(xué)生感染陽(yáng)性率為2.1%[2]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類(lèi)長(zhǎng)度>200堿基的非編碼RNA。研究表明，lncRNA調(diào)控細(xì)胞多種生理過(guò)程，病理狀態(tài)下參與多種疾病包括腫瘤、感染、自身免疫病等的發(fā)生與發(fā)展，是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)[3-5]。本課題組前期研究表明，重組抗原p29作為潛在的疫苗在綿羊中展現(xiàn)出抗細(xì)粒棘球蚴感染的保護(hù)作用，具有作為包蟲(chóng)病疫苗轉(zhuǎn)化應(yīng)用的可能性[6]。然而lncRNA是否參與了p29的免疫保護(hù)作用尚不清楚。因此，本研究在小鼠腹腔繼發(fā)感染模型中，采用重組抗原p29免疫接種小鼠，收集血液中外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)，提取總lncRNA并測(cè)序，經(jīng)高通量測(cè)序及生物信息學(xué)分析，尋找p29免疫保護(hù)過(guò)程中的lncRNA差異分子，為豐富p29疫苗預(yù)防包蟲(chóng)病的分子機(jī)制提供基礎(chǔ)研究資料。

1 資料與方法

1.1 一般資料：45只BALB/c小鼠(雌性，8周齡，SPF 級(jí))購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，由寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)。原頭蚴來(lái)源于寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院手術(shù)切除包蟲(chóng)病患者的完整包囊。具體獲取步驟為：將手術(shù)剝離的包囊無(wú)菌轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室，無(wú)菌抽取囊液，4 ℃ 9 000×g離心20 min。將沉淀用PBS緩沖液 (pH 7.2，含有 1 000 μg/mL 青霉素和1 000 U/mL 鏈霉素)調(diào)整濃度為200 μl PBS中含有1 500個(gè)原頭蚴。原頭蚴活性采用臺(tái)盼藍(lán)染色鑒定，以確?；钚?90%。

1.2 主要試劑：配制PBS緩沖液的干粉、青霉素、鏈霉素、臺(tái)盼藍(lán)、淋巴細(xì)胞分離液均采購(gòu)于北京索萊寶生物有限公司。Magnetic Core試劑盒購(gòu)自美國(guó)Epicentre公司。Trizol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。RevertAid第一鏈cDNA合成試劑盒、熒光定量PCR試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。引物由上海生工生物技術(shù)公司合成。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組：雌性6～8周齡BALB/c 小鼠[n=45，體重為(25±5) g]，隨機(jī)分為3組(15只/組)：空白對(duì)照組、感染組、p29+感染組，其中，空白對(duì)照組既不感染也不免疫。p29+感染組每只小鼠第1周背部皮下多點(diǎn)免疫接種10 μg重組抗原p29+等體積弗氏完全佐劑；第3周、第5周分別加強(qiáng)免疫接種10 μg重組抗原p29+等體積弗氏不完全佐劑各一次。在實(shí)驗(yàn)第12周，感染組與p29+感染組每只小鼠腹腔注射(intraperitoneal，i.p.)1 500原頭蚴/200 μl PBS。在感染24周后，剖殺小鼠，采用高通量測(cè)序檢測(cè)各組外周血PBMC細(xì)胞中l(wèi)ncRNA分子的變化。

1.4 方法

1.4.1 提取小鼠外周血PBMCs:15 mL離心管中加入3 mL淋巴細(xì)胞分離液，隨后將抗凝管中血液樣本緩慢貼壁加入分離液上層，注意分層，4 ℃ 2 000×g 離心20 min；離心后，吸取中間白膜層到另一支新15 mL離心管，加入10 mL PBS緩沖液并混勻，4 ℃ 1 500×g 離心10 min；再用PBS緩沖液洗一遍，用于接下來(lái)的提取RNA。

1.4.2 提取總RNA并測(cè)序：將PBMCs細(xì)胞中加入1 mL Trizol試劑并混勻，室溫靜置10 min。隨后加入200 μl氯仿，迅速顛倒混勻15 s，室溫靜置5 min。4 ℃ 12 000×g 離心15 min，樣本分為3層，而RNA在上層水相中，故小心吸取上層水相至無(wú)RNA酶EP管，注意不要吸到有機(jī)相。隨后加入400 μl氯仿，4 ℃ 12 000×g 離心15 min。吸取上層水相液到新EP管，加入500 μl異丙醇(提前在-20 ℃冰箱內(nèi)預(yù)冷)，4 ℃ 14 000×g 離心30 min。棄上清液，加入500 μl 75%乙醇(用無(wú)RNA酶水配置，現(xiàn)用現(xiàn)配)混勻，離心后棄上清液。將含有RNA沉淀的EP管放在超凈工作臺(tái)中吹干，不能太干，否則不利于溶解。最后加入30 μl DEPC水，在OD 260/280 nm測(cè)定RNA濃度，并進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。隨后采用Magnetic Core試劑盒建立lncRNA文庫(kù)后，在中國(guó)科學(xué)院北京基因組研究所采用Illumina公司Hiseq 2 000高通量測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序分析。

1.4.3 生物信息學(xué)分析獲得差異lncRNA：測(cè)序原始數(shù)據(jù)經(jīng)質(zhì)量評(píng)估和前處理后，獲得高質(zhì)量reads，利用tophat 2軟件將高質(zhì)量reads比對(duì)到小鼠基因組上，并構(gòu)建轉(zhuǎn)錄本。全部reads用Cufflinks軟件正態(tài)分布化，獲得相互比較的表達(dá)數(shù)據(jù)，挑選出長(zhǎng)度>200 nt，并且轉(zhuǎn)錄本與Hmmer/pfam比對(duì)沒(méi)有比對(duì)到已知domain的轉(zhuǎn)錄本作為最終的候選lncRNA，差異lncRNA用Cuffidiff軟件按照P<0.05且fold change>2的標(biāo)準(zhǔn)獲得。

1.4.4 qRT-PCR驗(yàn)證：根據(jù)候選lncRNA序列，采用 primer 5.0軟件和同源性比較分析網(wǎng)站http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi設(shè)計(jì)引物并由上海生工公司合成。將之前提取的總RNA備份，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，隨后采用特異性引物PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：預(yù)變性95 ℃ 2 min，PCR反應(yīng)變性95 ℃ 10 s，退火58 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；溶解曲線 95 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃延伸，36個(gè)循環(huán)。以GAPDH(F：AGGTCGGTGTGAACGGATTTG;R：GGGGTCGTTGATGGCAACA)為內(nèi)參，每個(gè)差異分子分別做3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次試驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 高通量測(cè)序及生物信息學(xué)分析獲得p29免疫后感染原頭蚴小鼠PBMCs中的差異lncRNA:通過(guò)二代高通量測(cè)序，所有reads每一個(gè)位置統(tǒng)計(jì)質(zhì)量均值的分布正常(圖1,目錄后)。進(jìn)一步采用生物信息學(xué)分析測(cè)序數(shù)據(jù)，與感染組相比，p29+感染組PBMCs中共有30個(gè)顯著差異的lncRNA分子(P<0.05)，見(jiàn)表1-表2。

表1 空白對(duì)照組與p29+感染組的差異表達(dá)lncRNAs分子

表2 p29+感染組與感染組相比小鼠PBMCs中的差異表達(dá)lncRNAs

lncRNAlocus位置P值XLOC-016148 chr18:80571823-80606059 <0.05INTE-017619chr13:24501351-24510967 <0.05XLOC-010435chr14:25128119-25143354<0.05XLOC-002881 chr10:122117717-122135230 <0.05INTE-015204 chr12:99634636-99651115<0.05ANTI-047891chr3:60733771-61008987<0.05INTE-053834chr4:144871176-144928209 <0.05INTE-076608chr9:43991300-43995380<0.05INTE-047119 chr3:138925901-139076392 <0.05INTE-021333chr14:32076997-32080015<0.05INTE-055681chr5:92126629-92133689<0.05INTE-053354 chr4:129019384-129034617<0.05ANTI-018836 chr13:111882255-111884418 <0.05INTE-026966 chr15:74899119-74911337<0.05

2.2 qRT-PCR驗(yàn)證p29免疫后感染原頭蚴小鼠PBMCs中的候選差異lncRNA：將上述測(cè)序獲得的30個(gè)lncRNA差異分子進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證，與感染組相比，p29+感染組PBMC細(xì)胞中l(wèi)ncRNA分子X(jué)LOC-012763顯著降低(P<0.05)，INTE-015204顯著降低(P<0.05)，INTE-028446顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)圖2(目錄后)。而這三個(gè)分子在空白組與感染組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2，目錄后)。經(jīng)生物信息學(xué)初步分析發(fā)現(xiàn)，XLOC-012763與 Dab2ip、Hc、Trem、Oas3基因可能相關(guān)，INTE-015204與klf4、Patz1、Cxxl2基因調(diào)控可能相關(guān)性，INTE-028446與klf4、Jchain基因可能有關(guān)聯(lián)性。

3 討論

包蟲(chóng)病分為泡型和囊型兩種，在我國(guó)西部地區(qū)包括寧夏南部山區(qū)主要以囊型為主，故本研究采用了細(xì)粒棘球蚴感染小鼠模型開(kāi)展研究。本研究前期證實(shí)，重組抗原p29疫苗免疫接種綿羊能夠獲得90%以上的保護(hù)力，表明該基因工程重組疫苗p29具有較好的抗包蟲(chóng)感染效果[6]。進(jìn)一步研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)p29疫苗免疫后，抗包蟲(chóng)特異性抗體IgE、IgG及其亞型IgG1、IgG2均顯著增加，Th1型細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ顯著升高。這些結(jié)果提示p29免疫接種后，顯著激活了特異性體液免疫應(yīng)答，同時(shí)有效活化了抗寄生蟲(chóng)感染的Th1細(xì)胞，初步說(shuō)明了p29保護(hù)作用的相關(guān)免疫機(jī)制[6-7]。然而，p29疫苗接種后如何激活免疫、產(chǎn)生保護(hù)力的確切細(xì)胞及其信號(hào)通路分子機(jī)制仍不清楚，故本研究團(tuán)隊(duì)試圖從非編碼RNA調(diào)控免疫機(jī)制方面展開(kāi)研究。就本研究而言，試圖尋找在p29免疫保護(hù)作用下感染原頭蚴小鼠PBMCs中l(wèi)ncRNA表達(dá)的變化。

LncRNA是一種長(zhǎng)度>200 nt的非編碼RNA，在基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮重要作用[8]。隨著基因組計(jì)劃的完成，研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌的基因組編碼6 000個(gè)基因，線蟲(chóng)的基因組編碼19 000個(gè)基因，果蠅的基因組編碼14 000個(gè)基因，而人的基因組也就只編碼20 000～25 000個(gè)基因，這表明高等生物的復(fù)雜性并不是由基因組所編碼的基因數(shù)目所決定的[9]。低等生物到高等生物基因數(shù)目相差不多，但是非編碼區(qū)域占比越來(lái)越高；人類(lèi)基因組轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物約98%是不編碼蛋白質(zhì)的RNA，表明高等生物的復(fù)雜性可能是由非編碼區(qū)域決定的[10]。與microRNA相比，lncRNA的調(diào)控作用形式更加復(fù)雜，這為lncRNA調(diào)控研究帶來(lái)了一定的難度[11]。但是，隨著高通量測(cè)序技術(shù)的不斷革新，lncRNA作為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)，已被證實(shí)在腫瘤、感染、自身免疫、慢性代謝性疾病等多種疾病中發(fā)揮重要作用。然而，lncRNA在寄生蟲(chóng)感染中的作用與機(jī)制研究相對(duì)較少，且多數(shù)是原蟲(chóng)類(lèi)，如瘧原蟲(chóng)感染中發(fā)現(xiàn)lncRNA分子發(fā)揮重要調(diào)控作用[12]。我們采用高通量測(cè)序，首次在p29免疫保護(hù)細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)感染中發(fā)現(xiàn)了30個(gè)lncRNA差異分子，隨后進(jìn)一步通過(guò)qRT-PCR驗(yàn)證獲得3個(gè)lncRNA候選分子?；趌ncRNA和mRNA的調(diào)控關(guān)系，其中，XLOC-012763與 Dab2ip、Hc、Trem、Oas 3基因可能相關(guān)，INTE-015204與klf4、Patz1、Cxxl2基因可能調(diào)控相關(guān)，INTE-028446與klf4、Jchain基因可能有關(guān)聯(lián)[13-15]。目前我們正在展開(kāi)p29免疫轉(zhuǎn)錄組測(cè)序工作，這將為確定差異lncRNA分子的作用靶基因提供依據(jù)。此外，由于PBMC細(xì)胞是一群異質(zhì)性細(xì)胞，為了進(jìn)一步尋找可能參與p29免疫保護(hù)的關(guān)鍵細(xì)胞，體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)包括Th0細(xì)胞、Th1細(xì)胞、Th2細(xì)胞、DC等，將有助于找出上述lncRNA分子作用的免疫細(xì)胞。

近年，越來(lái)越多的研究證實(shí)，外周血液循環(huán)中l(wèi)ncRNA可能成為一些疾病潛在的生物標(biāo)志物[16-17]。本研究中找到的外周血PBMC差異lncRNA分子亦有可能存在于外周血漿中，故檢測(cè)臨床包蟲(chóng)病患者外周血漿中這些分子的表達(dá)情況，分析ROC曲線，將有助于評(píng)價(jià)其是否具有成為生物標(biāo)志物的可能性。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)了p29免疫小鼠細(xì)粒棘球蚴感染中l(wèi)ncRNA存在顯著變化，證實(shí)了3個(gè)lncRNA差異分子，提示這些lncRNA差異分子可能參與了p29的疫苗保護(hù)作用，為p29疫苗的進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)。