肖遙 吳雙 黃為鈞 孫瑞茜 蔣里 張耀夫 趙進喜 傅強

2型糖尿病是臨床常見的慢性內(nèi)分泌代謝性疾病，其發(fā)生、發(fā)展和遺傳、飲食、環(huán)境等多種因素有關(guān)。近年來，有研究顯示，腸道菌群和2型糖尿病的發(fā)生、發(fā)展存在一定聯(lián)系，2型糖尿病的發(fā)病可能與腸道菌群失調(diào)有關(guān)[1-4]。將微生物作為生物標(biāo)志物以分析慢性病的進展、靶向性調(diào)控菌群以改善疾病等，已經(jīng)成為了基礎(chǔ)及轉(zhuǎn)化研究關(guān)注的熱點。傳統(tǒng)的細(xì)菌研究方法依賴于微生物培養(yǎng)和分離鑒定，但是絕大多數(shù)菌群無法在日常環(huán)境下通過傳統(tǒng)手段獲得。16s rDNA測序技術(shù)不需要對樣本中菌群進行培養(yǎng)，而是直接對樣本進行核酸提取，測定其所有微生物的核酸序列，這使得探索菌群構(gòu)成差異、篩查病原體標(biāo)志物成為可能。本研究基于16s rDNA測序的技術(shù)手段，對陽明、太陰不同體質(zhì)2型糖尿病患者腸道菌群進行分析，探究2型糖尿病腸道菌群與中醫(yī)陽明、太陰體質(zhì)的關(guān)系。

1 對象與方法

1.1 對象

研究對象為2017年1月至2018年6月期間，北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院腎病內(nèi)分泌科收治的新發(fā)2型糖尿病患者30例，其中男18例，女12例，年齡27～65歲，平均(46.47±11.92)歲。健康對照組13例，其中男8例，女5例，年齡25～65歲，平均(45.54±12.19)歲。研究經(jīng)由北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)

(1)經(jīng)由內(nèi)分泌?？漆t(yī)師根據(jù)中華醫(yī)學(xué)會糖尿病學(xué)分會制定的《中國2型糖尿病防治指南》[5](2013年版)評估后確診的2型糖尿病患者；(2)病程≤3個月的新發(fā)2型糖尿病患者；(3)經(jīng)由《三陰三陽體質(zhì)辨識量表》[6]進行體質(zhì)測評，測評結(jié)果經(jīng)計算機自動判讀，符合陽明胃熱體質(zhì)(簡稱陽明體質(zhì))和太陰脾虛體質(zhì)(簡稱太陰體質(zhì))的患者；(4)自愿參加本項目并簽署知情同意書。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn)

(1)存在嚴(yán)重肝腎疾病、心腦血管疾病、腫瘤、炎癥性腸病等疾病的患者；(2)受試者采樣前1個月內(nèi)服用抗生素、糖皮質(zhì)激素等藥物，采樣前2周內(nèi)服用微生物制劑等可能對腸道菌群有較大影響的藥物。

1.4 分組

對符合2型糖尿病診斷和納入標(biāo)準(zhǔn)的2型糖尿病患者和健康者，并經(jīng)由《三陰三陽體質(zhì)辨識量表》測評和計算機自動判讀為陽明體質(zhì)和太陰體質(zhì)。健康對照組選擇性別及年齡與疾病組相匹配，且符合陽明胃熱體質(zhì)和太陰脾虛體質(zhì)的受試者。入組陽明體質(zhì)2型糖尿病組14例，太陰體質(zhì)2型糖尿病組16例；陽明體質(zhì)健康組6例，太陰體質(zhì)健康組7例。

1.5 糞便標(biāo)本采集

用糞便收集器采集糖尿病觀察組與健康對照組患者新鮮糞便樣本2～3 g，迅速放入-80℃保存。

1.6 各組樣本菌群DNA提取與測序

1.6.1 提取 使用QIA amp Power Fecal DNA試劑盒(QIAGEN，德國)從0.5 g糞便樣品中提取DNA。選取細(xì)菌16s rDNA的V3～V4區(qū)序列進行基因擴增及基因測序。所用引物序列為：541F，5’-CTACGGGNBGCASCAG-3’；805R，5’-CTACNVGGGTATCTAATCC-3’。PCR反應(yīng)體系包括：5 μL 5×GC緩沖液，0.5 μL KAPA dNTP Mix，0.5 μL KAPA HiFi Hot Start DNA聚合酶，0.5 μL引物(10 pM)和50～100 ng模板DNA混合成25 μL體系。使用AMPure XP磁珠純化PCR產(chǎn)物，去除游離引物和引物二聚體等。使用引物擴增PCR純化的產(chǎn)物。然后配置25 μL PCR反應(yīng)體系包括，5 μL 5×GC緩沖液，0.75 μL KAPA dNTP Mix，0.5 μL KAPA HiFi Hot Start DNA聚合酶，1.5 μL引物(10 pM)和5 μL純化產(chǎn)物。PCR反應(yīng)條件包括95℃ 3分鐘，然后8個循環(huán)，95℃ 30秒，55℃ 30秒，72℃ 30秒，最后72℃延伸5分鐘。隨后通過AMPure XP磁珠純化擴增產(chǎn)物形成文庫。

1.6.2 測序 使用Illumina Hiseq測序平臺完成16s rDNA V3～4區(qū)測序。

1.7 陽明、太陰體質(zhì)2型糖尿病患者腸道菌群生物信息學(xué)數(shù)據(jù)處理與分析

采用快速短讀取長度裝配工具(Fast Length Adjustment of SHort reads，F(xiàn)LASH，是一個快速且精確的雙端測序reads融合工具)軟件將測序得到的雙端序列拼接成一條目標(biāo)區(qū)域序列[7]。對目標(biāo)序列進行質(zhì)控過濾，過濾后的序列與參考數(shù)據(jù)庫(USEARCH 64 bit v8.0.1517)作比對，去除嵌合體序列得到最終優(yōu)化序列。通過隨機減法，根據(jù)樣本的最小值對每個樣本的讀取次數(shù)進行歸一化。根據(jù)97%的序列相似性水平，利用微生物組定量分析(Quantitative Insights to microecology,QIIME[8])軟件包中的Uclust算法進行可操作分類單元(Operational Taxonomic Units，OTUs)聚類分析?；赟ilva參考數(shù)據(jù)庫對每個樣品的OTUs進行物種分類學(xué)注釋。

1.7.1 腸道菌群Alpha多樣性分析 根據(jù)QIIME并基于加權(quán)和非加權(quán)Unifrac距離矩陣計算樣本的Alpha多樣性[8]。Alpha多樣性可以體現(xiàn)組內(nèi)微生物群落的豐富度和多樣性。計算菌群豐富度的指數(shù)為查奧指數(shù)(Chao)、艾斯指數(shù)(Ace)、多樣性香農(nóng)指數(shù)(Shannon)、辛普森指數(shù)(Simpson)。分析陽明、太陰體質(zhì)2型糖尿病患者不同組別所含的腸道菌群、種屬總數(shù)量。

1.7.2 腸道菌群OTUs聚類分析 對測序有效數(shù)據(jù)，進行OTUs聚類和豐度統(tǒng)計。分析陽明、太陰體質(zhì)2型糖尿病患者和健康者腸道菌群組分?jǐn)?shù)量。

1.7.3 腸道菌群群落結(jié)構(gòu)組成分析 在OTU分類學(xué)基礎(chǔ)上，分析陽明、太陰體質(zhì)2型糖尿病患者及健康者腸道菌群的群落組成及分布。

1.7.4 腸道菌群物種差異分析 檢測糖尿病組、對照組中不同體質(zhì)患者組間豐度差異顯著的物種，基于顯著差異物種進行組間分析，使用線性判別分析(Linear Discriminant Analysis，LDA)、效應(yīng)大小(LEfSe)方法來識別群體間豐度差異具有統(tǒng)計學(xué)意義的物種[9]，作為組間顯著差異的生物標(biāo)志物，篩選出對陽明、太陰體質(zhì)2型糖尿病劃分產(chǎn)生顯著性差異影響的群落。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 陽明、太陰體質(zhì)2型糖尿病患者腸道菌群Alpha多樣性分析

對陽明、太陰體質(zhì)2型糖尿病患者及健康者腸道菌群不同菌落Alpha多樣性分析結(jié)果，見表1。陽明體質(zhì)2型糖尿病組、太陰體質(zhì)2型糖尿病組與陽明體質(zhì)健康組、太陰體質(zhì)健康組各組間菌群豐度Chao指數(shù)、Ace指數(shù)，多樣性Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)，無顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。提示陽明、太陰體質(zhì)2型糖尿病患者及健康者所含的腸道菌群總數(shù)量、種屬總數(shù)量基本一致。

2.2 陽明、太陰體質(zhì)2型糖尿病患者腸道菌群OTUs聚類分析結(jié)果

對陽明、太陰體質(zhì)2型糖尿病患者及健康者腸道菌群測序有效數(shù)據(jù)進行OTUs聚類和豐度統(tǒng)計，43個糞便樣本測序一共得到12388個OTUs，平均每個樣本包含288個OTUs，各樣本中含有的OTUs數(shù)量，見圖1。所有序列依據(jù)97%相似度水平劃分為607個OTUs，繪制可直觀表現(xiàn)三組OTU數(shù)目組成相似性及重疊情況的Venn圖，見圖2。結(jié)果顯示，太陰體質(zhì)健康組組OTUs數(shù)目為539；太陰體質(zhì)糖尿病組OTUs數(shù)目為579；陽明體質(zhì)健康組組OTUs數(shù)目為527；陽明體質(zhì)糖尿病組組OTUs數(shù)目為579。其中484個OTUs為四組共有，達到79.74%，說明四組間的OTUs相似性較高。提示陽明、太陰體質(zhì)2型糖尿病患者及健康者各組具有共同種屬腸道菌群種屬。

在陽明、太陰體質(zhì)2型糖尿病患者以健康者四組中，各組均檢出其特異的OTUs，其中陽明體質(zhì)糖尿病組為4個，太陰體質(zhì)糖尿病組為11個，陽明體質(zhì)健康組為2個，太陰體質(zhì)健康組為2個，結(jié)果見圖2。提示陽明體質(zhì)2型糖尿病患者與太陰體質(zhì)2型糖尿病患者二者腸道菌群具有特異性。

2.3 陽明、太陰體質(zhì)2型糖尿病患者腸道菌群群落結(jié)構(gòu)組成分析結(jié)果

對陽明、太陰體質(zhì)2型糖尿病患者及健康者腸道菌群的群落組成分析，結(jié)果見圖3。菌群結(jié)構(gòu)由4個主要的菌門組成(將檢測到的豐度低于1%的菌群合并為其他)：厚壁菌門、放線菌門、擬桿菌門、變形菌門，在部分樣本中也檢測到了梭桿菌門。在陽明、太陰體質(zhì)2型糖尿病患者及健康者腸道菌群中均存在上述4個菌門。

表1 陽明、太陰體質(zhì)2型糖尿病患者與健康組Alpha多樣性分析結(jié)果

注：陽明、太陰體質(zhì)2型糖尿病及健康組腸道菌群樣本編號(TD：太陰體質(zhì)健康組；TS：太陰體質(zhì)糖尿病組；YD：陽明體質(zhì)健康組；YS：陽明體質(zhì)糖尿病組)

圖1 陽明、太陰體質(zhì)2型糖尿病患者腸道菌群OTUs聚類分析結(jié)果

注：YS：陽明體質(zhì)糖尿病組；TS：太陰體質(zhì)糖尿??；YD：陽明體質(zhì)健康組；TD：太陰體質(zhì)健康組)

圖2 陽明、太陰體質(zhì)2型糖尿病患者及健康者OTUs韋恩示意圖

2.4 陽明、太陰體質(zhì)2型糖尿病患者腸道菌群物種差異分析結(jié)果

對全體樣本進行LEfSe分析，評估差異顯著的物種的影響力大小(即LDA score)，找出對樣本劃分產(chǎn)生顯著性差異影響的群落或物種，結(jié)果見圖4。太陰體質(zhì)糖尿病組有顯著特異性的群落，腸道菌群擬桿菌綱、擬桿菌目、擬桿菌門、擬桿菌科、擬桿菌屬、紫單胞菌科、薩特氏菌屬、副桿狀菌屬、理研菌科、另枝菌屬10個菌群組分升高。而陽明體質(zhì)2型糖尿病組、陽明體質(zhì)健康組、太陰體質(zhì)健康組在組別對比中，LDA分值圖無顯示，表明無顯著特異性的群落。

在2型糖尿病患者中，太陰體質(zhì)2型糖尿病組檢測到11種顯著升高的腸道菌群組分，分別是伯克氏菌目、產(chǎn)堿桿菌科、β-變形菌綱、理研菌科、另枝菌屬、瘤胃菌科、紫單胞菌科副桿菌屬、擬桿菌綱、擬桿菌目、擬桿菌門，以擬桿菌門等為主；陽明體質(zhì)糖尿病組檢測到2種顯著升高的腸道菌群組分，分別是厚壁菌門及模糊分類群，以厚壁菌門等為主。表明二者腸道菌群組分存在差異，結(jié)果見圖5。

3 討論

3.1 糖尿病患者腸道菌群與陽明、太陰體質(zhì)具有相關(guān)性

早在《黃帝內(nèi)經(jīng)》時期，古代醫(yī)家已經(jīng)認(rèn)識到消渴病與腸道的密切聯(lián)系，如《素問·陰陽別論篇》載有“二陽結(jié)謂之消”的論述。近年來，隨著腸道菌群的結(jié)構(gòu)與功能成為生物學(xué)和醫(yī)學(xué)的研究熱點，中國人群中糖尿病患者與非糖尿病患者在腸道微生物組成上的差異得到證實，2型糖尿病與腸道菌群具有相關(guān)性[10]。

注：陽明、太陰體質(zhì)2型糖尿病及健康組腸道菌群樣本編號(TD：太陰體質(zhì)健康組；TS：太陰體質(zhì)糖尿病組；YD：陽明體質(zhì)健康組；YS：陽明體質(zhì)糖尿病組)

圖3 陽明、太陰體質(zhì)2型糖尿病患者及健康者腸道菌群在門分類水平的組成結(jié)構(gòu)圖

圖4 LEfSe分析組間具有統(tǒng)計學(xué)差異的生物標(biāo)記物

圖5 LEfSe分析陽明、太陰2型糖尿病組組間具有統(tǒng)計學(xué)差異的生物標(biāo)記物

有學(xué)者研究了健康人群中，體形胖瘦與消化道菌群的關(guān)系，體型消瘦者消化道中的菌群主要以擬桿菌為主，而肥胖者消化道中厚壁菌更多[11-13]。但中國人的體質(zhì)分類，不是簡單的分為體形消瘦與肥胖，以體質(zhì)胖瘦不能反映中國人體質(zhì)與腸道菌群的深層關(guān)系。也有學(xué)者研究了糖尿病與健康人群的腸道菌群特點，2型糖尿病患者相較于健康人群的腸道菌群存在厚壁菌門、擬桿菌門豐度的變化特點[14-15]。但臨床上糖尿病的證候變化多樣，僅以后壁菌門和擬桿菌門豐度變化也不能反映其證候特點。

趙進喜教授[16]認(rèn)為，中醫(yī)證候與腸道菌群的相關(guān)性研究，不能脫離體質(zhì)。應(yīng)該基于臨床，基于不同體質(zhì)的人進行證候與腸道菌群的相關(guān)性研究。體質(zhì)是糖尿病及其并發(fā)癥發(fā)生、發(fā)展的基礎(chǔ)[17]。臨床上不同體質(zhì)的人，患糖尿病后，會表現(xiàn)出不同系統(tǒng)的病變證候，進一步的發(fā)生并發(fā)癥也各有特點。如陽明體質(zhì)者常表現(xiàn)為胃腸結(jié)熱證，太陰體質(zhì)者常表現(xiàn)為脾胃虛弱證。注重辨三陰三陽體質(zhì)[16-17]，并通過其指導(dǎo)臨床治療糖尿病及其并發(fā)癥，常常能取得滿意的療效。既然體質(zhì)是糖尿病不同證候的內(nèi)在發(fā)生基礎(chǔ)，對于2型糖尿病患者腸道菌群變化對不同體質(zhì)所表現(xiàn)出來的證候及其與三陰三陽體質(zhì)中的陽明、太陰體質(zhì)是否有關(guān)等問題的研究尚未見報道。因此，課題組采用16s rDNA測序的技術(shù)手段，進行了2型糖尿病患者腸道菌群與陽明、太陰體質(zhì)的初步相關(guān)研究，以揭示腸道菌群變化與陽明、太陰體質(zhì)之間的內(nèi)在聯(lián)系。

本研究結(jié)果顯示，陽明、太陰體質(zhì)2型糖尿病患者與健康者所含的腸道菌群總數(shù)量、種屬總數(shù)量是一致的，腸道菌群結(jié)構(gòu)也基本一致。它們既有共同的菌群種屬，又有各自獨有的菌群種屬，表現(xiàn)為菌群失調(diào)。腸道菌群組分的變化，在太陰體質(zhì)2型糖尿病組與陽明體質(zhì)2型糖尿病組之間存在著顯著差異，太陰體質(zhì)2型糖尿病組有11種顯著升高的腸道菌群組分，主要差異物種以擬桿菌門等為主；陽明體質(zhì)2型糖尿病組有2種顯著升高的腸道菌群組分，主要差異物種以厚壁菌門等為主。2型糖尿病患者腸道菌群因不同的體質(zhì)類型而表現(xiàn)出不同的菌群特征，說明2型糖尿病患者腸道菌群變化與陽明、太陰不同體質(zhì)有一定關(guān)系。

3.2 糖尿病患者腸道菌群變化可能是形成陽明、太陰體質(zhì)差異的內(nèi)在因素

陽明胃熱體質(zhì)和太陰脾虛體質(zhì)都是容易發(fā)生糖尿病的體質(zhì)類型。一般來講，陽明體質(zhì)之人，平素體壯，能吃、能睡、能干，有便干傾向，患病可發(fā)生糖尿病胃腸病變便秘。太陰體質(zhì)之人，體質(zhì)相對虛弱，平素食欲較差，有腹瀉傾向，面色黃，消瘦或虛胖，患病可發(fā)展為糖尿病胃腸植物神經(jīng)病變等。糖尿病發(fā)病后表現(xiàn)為陽明胃熱體質(zhì)和太陰脾虛體質(zhì)不同的證候特點，可能與糖尿病腸道菌群變化不同有關(guān)。本研究證實，2型糖尿病患者太陰體質(zhì)組以擬桿菌門等為主，陽明體質(zhì)組以厚壁菌門等為主。

腸道菌群作為環(huán)境因素調(diào)節(jié)脂肪存儲[18]，在肥胖者腸道菌群中厚壁菌增多而擬桿菌減少，擬桿菌與厚壁菌比值下降。厚壁菌門為革蘭陽性菌，擬桿菌門為革蘭陰性，兩者占腸道細(xì)菌總數(shù)的98%以上。擬桿菌主要產(chǎn)生乙酸鹽和丙酸鹽，厚壁菌產(chǎn)生丁酸鹽。乙酸是膽固醇合成的底物，丙酸影響脂肪生成和糖異生。丁酸是結(jié)腸細(xì)胞的主要能量來源。后壁菌門可以促進機體對能量的利用，陽明體質(zhì)偏于肥胖，可能與陽明體質(zhì)2型糖尿病腸道菌群以厚壁菌門為主有關(guān)。擬桿菌門參與多糖代謝、膽汁酸和類固醇代謝等諸多功能，也可以發(fā)酵碳水化合物。腸道革蘭陰性桿菌過度生長繁殖，導(dǎo)致腸道原有的黏膜屏障受到破壞，使腸道通透性增高，大量的細(xì)菌內(nèi)毒素(LPS)通過損害的腸黏膜屏障進入組織，通過免疫細(xì)胞表面的信號傳導(dǎo)通路(LPS/CD14/TLP4)激活炎癥的級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致機體產(chǎn)生慢性炎癥反應(yīng)[19]；細(xì)菌內(nèi)毒素又是調(diào)節(jié)胰島素抵抗(IR)的關(guān)鍵因素，可引起IR。腸道慢性炎癥，大便容易腹瀉，使人體消瘦，符合太陰體質(zhì)脾虛的表現(xiàn)，因此，太陰體質(zhì)偏于消瘦，可能與太陰體質(zhì)2型糖尿病以擬桿菌門等為主有關(guān)。另外，太陰體質(zhì)2型糖尿病患者腸道菌群中還存在伯克氏菌目和產(chǎn)堿桿菌等。伯克氏菌目是β-變形菌綱的一個目。變形菌門在正常腸道內(nèi)含量較低，常低于8%，多數(shù)為致病菌。產(chǎn)堿桿菌為產(chǎn)堿桿菌科中重要的一種，一般寄生于動物腸道中，也是一種條件致病菌[20]。這些致病菌的存在，引起或加重了腸道慢性炎癥，支持糖尿病太陰體質(zhì)患者腹瀉、消瘦、身體較弱、納食較差等臨床表現(xiàn)。

總之，2型糖尿病患者腸道菌群失調(diào)與陽明、太陰體質(zhì)有關(guān)，其腸道菌群的變化可能是形成陽明、太陰體質(zhì)差異的內(nèi)在因素。通過對不同體質(zhì)2型糖尿病患者腸道菌群差異進行分析，有助于深化三陰三陽體質(zhì)學(xué)說的科學(xué)內(nèi)涵，從而為指導(dǎo)臨床辨證論治提供參考。