趙雪琦，陳志新，冷平生，胡增輝

(北京農(nóng)學(xué)院 園林學(xué)院，北京 102206/北京農(nóng)學(xué)院林木分子設(shè)計(jì)育種高精尖創(chuàng)新中心，北京 102206)

干旱是農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)面臨的一個巨大難題，嚴(yán)重威脅著農(nóng)林業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。典型的景天科植物因其特殊的景天酸代謝(Crassulacean acid metabolism, CAM)模式，均具有較強(qiáng)的耐旱能力。CAM植物每固定1 g CO2或生產(chǎn)1 g干物質(zhì)，水分的消耗量均比傳統(tǒng)的C3或C4植物小[1,2]，并且通過CAM途徑固定的CO2能讓植物在碳獲取量最大的同時消耗更少的水分[3]，這幫助一些植物能在干旱環(huán)境下能更高效的利用水分，更好的適應(yīng)逆境條件。

八寶(Hylotelephiumerythrostictum(Miq.) H. Ohba)為景天科八寶屬多年生肉質(zhì)草本植物，也是典型的兼性CAM植物。因其管理粗放，但景觀效果好并且抗旱性強(qiáng)的特點(diǎn)，近年來已經(jīng)成為城市園林綠化與生態(tài)建設(shè)中不可缺少的地被植物。目前國內(nèi)外對八寶的研究主要集中在繁育技術(shù)[4-5]、園林應(yīng)用[6-7]、化學(xué)成分方面[8-9]；對其抗性的研究主要集中在耐鹽脅迫[10]、重金屬脅迫[11]等。雖然也有關(guān)于八寶耐旱性的相關(guān)報道[12]，但只是對八寶一天中白天和夜晚的生理變化進(jìn)行了研究，缺乏長時間、脅迫程度更高的觀察研究，對其耐旱機(jī)制了解不夠。通過控制土壤水分的方式來進(jìn)行干旱脅迫容易造成土壤濕度不均勻的問題，使用類似甘露醇等的滲透調(diào)節(jié)劑又易對植物產(chǎn)生離子毒害，而PEG6000(聚乙二醇6000)因較高的分子量導(dǎo)致其不能自由的通過植物細(xì)胞壁，從而不會的對植物細(xì)胞造成離子毒害，同時又能引起滲透脅迫，因此使用PEG模擬干旱脅迫是一個較好的選擇。

本試驗(yàn)使用PEG6000模擬干旱脅迫處理八寶水培苗，測定葉片相關(guān)生理指標(biāo)，研究八寶葉片對干旱脅迫的生理響應(yīng)，為揭示八寶的抗旱機(jī)理及其應(yīng)用推廣提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

植物材料采自北京農(nóng)學(xué)院東大地，剪取健康且長勢一致的八寶幼苗進(jìn)行水培扦插，培養(yǎng)液為1/4Hoagland營養(yǎng)液，每3 d更換1次。光周期為14 h光照/10 h黑暗，晝夜溫度為24 ℃/20 ℃，相對濕度30 %。待生長25 d長出6～8片功能葉時，選取長勢一致的幼苗進(jìn)行脅迫處理。試驗(yàn)于2019年4月至7月在北京農(nóng)學(xué)院園林學(xué)院進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 PEG處理 試驗(yàn)共設(shè)置5個處理，分別為：CK(1/4Hoagland營養(yǎng)液)、10%PEG、20%PEG、30%PEG、40%PEG，每個處理設(shè)置3次重復(fù)。所有處理溶液均用1/4Hoagland營養(yǎng)液配制，為保證處理溶液濃度的穩(wěn)定性，每隔3 d更換1次處理液。分別于處理后的第0、3、6、9、15、20、25、30 天進(jìn)行采樣。采樣后立即放入液氮中淬冷，之后貯存于-80 ℃超低溫冰箱備用。

1.2.2 相對含水量測定 葉片的相對含水量(RWC)采用烘干法[13]測定。剪取植物成熟葉片立即稱質(zhì)量(記為鮮質(zhì)量)，然后將葉片放入加有蒸餾水的錐形瓶中，靜置24 h后取出葉片，用濾紙吸干葉片表面水分并稱質(zhì)量(記為飽和鮮質(zhì)量)，最后將葉片放入烘箱中，105 ℃殺青30 min，80 ℃烘干至恒質(zhì)量(記為干質(zhì)量)。每組處理重復(fù)3次。相對含水量%=[(鮮質(zhì)量-干質(zhì)量)/(飽和-干質(zhì)量)]×100%。

1.2.3 相對電導(dǎo)率測定 相對電導(dǎo)率(REC)的測定參考陳志新[10]的方法，選取成熟葉片用打孔器打10個圓形葉片，加5 mL蒸餾水，用真空抽氣泵抽氣30 min，震蕩后室溫靜置30 min測溶液電導(dǎo)率；隨后沸水浴10 min并迅速冷卻至室溫，測煮沸后的電導(dǎo)率。相對電導(dǎo)率(%)=(未煮沸電導(dǎo)率/煮沸電導(dǎo)率)×100%。

1.2.4 丙二醛含量測定 丙二醛(MDA)含量的測定采用硫代巴比妥酸比色法[14]。稱取0.2 g葉片，加入10 mL10%三氯乙酸和少量石英砂，研磨至勻漿，轉(zhuǎn)移勻漿到試管中，4 000 r/min離心10 min，上清液即丙二醛提取液。取2 mL提取液(對照管加2 mL蒸餾水)加2 mL 0.6%硫代巴比妥酸搖勻。混合液在沸水浴中反應(yīng)10 min，取出試管迅速冷卻，4 000 r/min離心10 min，取上清分別在532、450、600 nm處測吸光值。

CMDA=6.45(A532-A600)-0.56A450(μmol/L)；MDA含量(μmol/g)=(CMDA×提取液總體積)/樣品質(zhì)量。CMDA為MDA的濃度，A532、A450、A600分別代表450 nm、532 nm和600 nm波長下的吸光度值。

1.2.5 可溶性糖含量測定 可溶性糖含量的測定采用蒽酮比色法[15]。稱取0.2 g葉片，加入10 mL蒸餾水研磨至勻漿，轉(zhuǎn)到10 mL離心管中，于沸水中提取30 min，過濾至25 mL容量瓶中定容，即樣本提取液。吸取樣品提取液0.5 mL于10 mL離心管中，加1.5 mL蒸餾水、0.5 mL蒽酮乙酸乙酯和5 mL濃硫酸，沸水浴中精確保溫1 min，自然冷卻至室溫后搖勻，在630 nm波長下測吸光度。

可溶性糖含量(%)=[(C×VT×n)/(W×VS×106)]×100。C：從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的含糖量;VT：提取液總體積(mL);VS：測定時取用的樣品提取液體積(mL);n：稀釋倍數(shù);W：樣品質(zhì)量(g) 。

1.2.6 脯氨酸含量測定 稱取0.2 g葉片，加5 mL 3%的磺基水楊酸溶液研磨至勻漿，轉(zhuǎn)移到試管中，沸水浴提取10 min，冷卻后過濾，濾液即為脯氨酸提取液[15]。吸取2 mL提取液于試管中，加入2 mL冰醋酸和2 mL 2.5%酸性茚三酮溶液，沸水浴加熱30 min。冷卻后加入4 mL甲苯，震蕩30 s，靜置片刻，用移液槍吸取脯氨酸紅色甲苯溶液于比色杯中，在波長520 nm處測吸光度值。

脯氨酸含量(μg/g)=(X×提取液總量)/(樣品鮮質(zhì)量×測定時提取液量)。式中X為從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的脯氨酸含量(μg)。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel軟件進(jìn)行處理作圖，用SPSS22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，并采用Duncan法檢驗(yàn)進(jìn)行差異比較(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱脅迫對八寶葉片相對含水量的影響

干旱脅迫第0天處理組與對照組葉片相對含水量無差異，但隨著處理濃度的增加和時間的延長，八寶葉片的相對含水量基本呈現(xiàn)下降的趨勢(圖1)。第3天開始，10%PEG脅迫下的八寶葉片相對含水量始終高于對照，但除了3 d外無顯著差異。20%PEG脅迫下，第6天相對含水量開始有明顯下降，下降了13%，到脅迫第30 d時下降了39.5%。在30%、40%PEG的脅迫下，第3天葉片相對含水量開始就有顯著下降，分別下降了25.7%和36%；之后脅迫的第6 天到30天，30%和40%PEG脅迫之間基本無顯著差異，第30天時，僅為對照的45.2%和41.6%。

注：不同大寫字母表示相同時間不同處理之間的差異顯著水平(P<0.05)，不同小寫字母表示相同處理不同時間之間的差異顯著水平(P<0.05)；圖2，表1，表2，表3相同Note:Different capital letters indicate significant difference among different treatmentsat the same time point (P<0.05). Different small letters indicate significant difference among different time points under the same treatment(P<0.05)；The same as Fig.2,Table 1,Table 2,Table 3圖1 干旱脅迫對八寶葉片相對含水量的影響Fig.1 Effect of drought stress on the relative water contents of H. erythrostictum leaves

2.2 干旱脅迫對八寶葉片相對電導(dǎo)率的影響

隨著干旱程度的增加和時間的延長，八寶葉片的相對電導(dǎo)率呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(圖2)，并且與對照相比都有顯著差異(P<0.05)。10%PEG脅迫的第3天和6天相對電導(dǎo)率僅增加了1.04倍和1.09倍；到第30天時，與對照相比增加了1.4倍。20%和30%PEG脅迫之間對八寶葉片相對電導(dǎo)率的影響差異不大。40%PEG脅迫在第30天最高，是對照的1.56倍。

圖2 干旱脅迫對八寶葉片相對電導(dǎo)率的影響Fig.2 Effect of drought stress on the relative electric conductivities of H. erythrostictum leaves

2.3 干旱脅迫對八寶葉片丙二醛含量的影響

如表1所示，八寶葉片丙二醛的含量隨著處理程度的增加和處理時間的延長而增加。10%PEG脅迫對葉片丙二醛含量的影響雖與對照有顯著差異，但增幅較小；第30天時與對照相比增加了2.44倍。20%和30%PEG脅迫的濃度之間只有第6天和15天有顯著差異，分別為對照的1.8倍、2.05倍和2.3倍、2.94倍。40%PEG脅迫30 d時的葉片丙二醛含量最高，為對照的4.88倍。

2.4 干旱脅迫對八寶葉片可溶性糖含量的影響

八寶葉片的可溶性糖含量隨著脅迫時間的延長和脅迫程度的升高而增加(表2)。相同脅迫時間下，不同脅迫濃度對葉片可溶性糖含量的影響基本均與對照有顯著差異(P<0.05)。10%和20%兩個濃度的脅迫之間基本無顯著差異；10%PEG脅迫的第20天和第30天與對照相比分別增加了1.28倍和1.43倍。20%PEG脅迫的第3天和15天分別與對照相比增加了1.15倍和1.34倍；脅迫20、25、30 d三個時間點(diǎn)之間無顯著差異，與對照相比分別增加了1.36倍、1.43倍和1.5倍。40%PEG脅迫第30天時，葉片的可溶性糖含量增幅最大，為對照的1.99倍。

表1 干旱脅迫對八寶葉片丙二醛含量的影響Tab.1 Effect ofdrought stress on the MDA contents of H. erythrostictum leaves

表2 干旱脅迫對八寶葉片可溶性糖含量的影響Tab.2 Effect of drought stress on the soluble sugar contents of H. erythrostictum leaves

2.5 干旱脅迫對八寶葉片脯氨酸含量的影響

如表3所示，干旱脅迫下八寶葉片的脯氨酸含量同樣隨著時間的延長和脅迫程度的增加而增加。10%、20%和30%PEG在脅迫的第3天和第6天的增幅不明顯，但在第9天時均急劇上升，分別為對照的3.31倍、3.5倍和3.86倍。40%PEG脅迫下，八寶葉片脯氨酸含量則在第6天就顯著上升，為對照的3.28倍；在脅迫第30天時，葉片脯氨酸含量最高為對照的13.99倍；與脅迫第0天相比，葉片脯氨酸含量增加了13.28倍。

表3 干旱脅迫對八寶葉片脯氨酸含量的影響Tab.3 Effect ofdrought stress on the proline contents of H. erythrostictum leaves

3 討 論

植物在受到干旱脅迫時能產(chǎn)生很多抗逆性的反應(yīng)，包括脫水反應(yīng)、滲透調(diào)節(jié)等。在逆境條件下，植物通過對干旱信號的感知、傳導(dǎo)，從而能引發(fā)一系列復(fù)雜的生理變化，各個變化是緊密聯(lián)系的綜合性反應(yīng)。因此本研究對PEG模擬干旱脅迫下的八寶葉片進(jìn)行了相關(guān)生理指標(biāo)的測定。

相對含水量是可以反映植物抗旱能力強(qiáng)弱的有效指標(biāo)之一。植物葉片含水量高、水分流失慢，則植物的抗旱性較強(qiáng)[14]。本試驗(yàn)中10%PEG脅迫處理下的八寶葉片相對含水量在整個處理周期都維持在較高的水平，說明輕度脅迫能使八寶葉片有更強(qiáng)的保水能力。20%PEG脅迫的第0～20天葉片相對含水量下降不明顯，說明該程度的脅迫前期并未對八寶造成顯著的影響。但是30%、40%PEG脅迫下，隨著脅迫濃度的升高和脅迫時間的延長，八寶葉片的相對含水量逐漸下降，這與景天科的長藥景天(H.spectabile)、德國景天(Sedumhybridum)等植物結(jié)果相似[16-17]。

植物組織在感受到干旱脅迫的危害時，細(xì)胞膜的功能和結(jié)構(gòu)最先受到損害，其中質(zhì)膜的相對透性和膜脂過氧化則反映了細(xì)胞膜的受損過程[18]。葉片相對電導(dǎo)率的大小可以作為衡量植物在脅迫下的受傷害程度。在干旱脅迫下，植物細(xì)胞膜的通透性增加，電解質(zhì)大量外滲，相對電導(dǎo)率增加。從圖2可以看出，在脅迫0～6 d期間八寶葉片的相對電導(dǎo)率增加幅度較小，到脅迫第9天時開始相對電導(dǎo)率增幅顯著，說明此時干旱脅迫已經(jīng)對八寶葉片的細(xì)胞膜造成了較明顯的損傷。MDA是膜脂過氧化的終產(chǎn)物也是重要產(chǎn)物之一，他的產(chǎn)生可以加劇細(xì)胞膜的損傷，其含量的高低一定程度上可以反映植物抗逆性的強(qiáng)弱。本試驗(yàn)中，10%PEG脅迫下八寶葉片的MDA含量增幅較為平緩；而20%、30%、40%PEG脅迫下，20～30 d時葉片MDA含量明顯提高，說明輕度干旱脅迫以及短期內(nèi)的中度或重度干旱脅迫對八寶葉片細(xì)胞膜造成的損傷較小，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗旱性，而脅迫20 d之后中度、重度干旱造成葉片膜脂過氧化程度較高，損傷較大。

滲透調(diào)節(jié)是植物在逆境條件下降低滲透勢，忍耐和抵御逆境脅迫的一種重要方式[19]。其中可溶性糖和脯氨酸是一類重要的參與滲透調(diào)節(jié)的有機(jī)溶質(zhì)，其含量的增加對提高細(xì)胞液濃度、植物吸水能力，降低植物細(xì)胞水勢十分有利[20]。在本試驗(yàn)中，隨著脅迫濃度的增加以及脅迫時間的延長，八寶葉片中可溶性糖含量和脯氨酸含量均不斷增加，這與其它試驗(yàn)結(jié)果一致[21]。說明在干旱脅迫下八寶啟動了防御機(jī)制，通過提高可溶性糖和脯氨酸含量來調(diào)節(jié)細(xì)胞的滲透壓，增強(qiáng)植物抗旱性，維持正常的生長發(fā)育。但是脯氨酸的增加程度遠(yuǎn)高于可溶性糖含量的增幅，也表明八寶主要是通過增加脯氨酸的含量來緩解干旱脅迫帶來的損傷。