王黎霞，宋麗聰 ，張建軍，安 健*

(1.北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院，北京 102442；2.北京農(nóng)學(xué)院 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 102206)

雞球蟲感染后入侵腸上皮細(xì)胞，引起雞精神萎靡，腸黏膜損傷，臨床血便，甚至死亡，嚴(yán)重影響家禽養(yǎng)殖業(yè)，全球每年因?yàn)榍蛳x及球蟲病造成的損失十分巨大，安健等前期研究發(fā)現(xiàn)，雞柔嫩艾美耳球蟲裂殖子入侵可以抑制MDBK細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)，深入研究入侵和凋亡抑制的機(jī)制，可以為研制新型抗球蟲疫苗和治療藥奠定基礎(chǔ)。

細(xì)胞凋亡時(shí)，線粒體跨膜電位發(fā)生改變，該情況與Bcl-2家族的凋亡因子有關(guān)，這些凋亡因子起抑制和促進(jìn)凋亡兩種作用，前者如Bcl-2、Bcl-W、Bcl-XL等，起凋亡抑制作用，后者如Bax、Bak、Bid等，起凋亡促進(jìn)作用[1]。Bcl-2是Ced9的同源物[1]。Bcl-2家族都有一個(gè)或者多個(gè)BH(硼氫酸特異結(jié)合位點(diǎn))結(jié)構(gòu)片段。試驗(yàn)證明Bax與Bcl調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡是依賴TM(單次跨膜區(qū))結(jié)構(gòu)域。凋亡早期，Bax與Bal-XL轉(zhuǎn)移到線粒體膜[2]。Bad因?yàn)闆]有TM片段而存在于胞漿，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡時(shí)，轉(zhuǎn)移到線粒體膜，除去TM后的Bcl-2抑制凋亡作用改變[3]。在無死亡信號刺激時(shí)，Bcl-2被膜蛋白包裹存在于胞質(zhì)中[4]。當(dāng)死亡信號刺激細(xì)胞后，Bcl-2發(fā)生構(gòu)象變化，移動到細(xì)胞器(主要是線粒體)的膜上，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。以上兩個(gè)分子主要定位于線粒體膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜等[5]，在誘導(dǎo)劑的作用后，Bcl-2和Bcl-xl被蛋白激酶磷酸化而啟動凋亡。Bax是最先被發(fā)現(xiàn)的促凋亡分子，Bid蛋白是Bcl -2家族中促凋亡類的蛋白，在細(xì)胞凋亡中起著重要的作用[6]。

本課題組前期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，乙醇可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，發(fā)現(xiàn)雞柔嫩艾美耳球蟲裂殖子入侵體MDBK細(xì)胞2.5 h后可以抑制細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)，本試驗(yàn)在雞柔嫩艾美耳球蟲裂殖子入侵體MDBK細(xì)胞后，用終濃度6%乙醇進(jìn)行凋亡誘導(dǎo)，采用qRT-PCR定量分析凋亡相關(guān)因子的變化，初步研究球蟲裂殖子入侵細(xì)胞后抗凋亡誘導(dǎo)的機(jī)制。

1 試驗(yàn)材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

E.tenella，河北某雞場分離，經(jīng)過單卵囊純化，保存于北京農(nóng)學(xué)院 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院試驗(yàn)室；MDBK細(xì)胞，中國農(nóng)業(yè)大學(xué)寄生蟲試驗(yàn)室饋贈；胎牛血清、DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、胰酶(購自Gibco公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

分離純化裂殖子，參考安健等的方法[7]。

試驗(yàn)共分4組，A組，未入侵，未誘導(dǎo)凋亡；B組，未入侵，誘導(dǎo)凋亡；C組，入侵，未誘導(dǎo)凋亡；D組，入侵，誘導(dǎo)凋亡。MDBK細(xì)胞培養(yǎng)于125 cm2的斜頸培養(yǎng)瓶中,于37 ℃，5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，胰酶消化，調(diào)整每瓶細(xì)胞達(dá)到3.0×105個(gè),培養(yǎng)溫度調(diào)至41 ℃，培養(yǎng)24 h后每瓶添加裂殖子9.0×105個(gè)，共培養(yǎng)1.5 h后，用Hank’s清洗細(xì)胞4次，除去未入侵細(xì)胞的裂殖子。用6%的乙醇培養(yǎng)基誘導(dǎo)凋亡培養(yǎng)2.5 h，然后胰蛋白酶消化3 min，收集細(xì)胞，用冷的PBS洗滌，1 000 r/min離心5 min，獲得MDBK細(xì)胞，RNA提取、反轉(zhuǎn)錄按試劑盒說明進(jìn)行。

根據(jù)GenBank中?；蛐蛄械腃Ds保守區(qū)設(shè)計(jì)Bcl-2、Bax、Bcl-XL、Bid和內(nèi)參基因β-actin的特異性引物(表1)，以β-actin為內(nèi)參qRT-PCR檢測Bcl-2、Bax、Bcl-XL、Bid的表達(dá)變化，qRT-PCR檢測按試劑盒說明進(jìn)行。

表1 Bcl-2、Bax、Bcl-XL、Bid和內(nèi)參基因β-actin的引物序列Tab.1 Primiers of Bcl-2,Bax,Bcl-XL,Bid and β-actin for PCR

數(shù)據(jù)處理采用SPSS17.0軟件進(jìn)行，用方差齊性檢驗(yàn)和單因素方差分析(One Way ANOVA)進(jìn)行多組間比較分析，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Bcl-xL基因表達(dá)變化

與未感染球蟲未誘導(dǎo)凋亡組比較，各試驗(yàn)組Bcl-xL基因表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)，但感染凋亡誘導(dǎo)組基因下調(diào)顯著大于未感染凋亡誘導(dǎo)組(圖1)(P<0.05)。

注：A.未感染球蟲，未誘導(dǎo)凋亡；B.未感染球蟲，誘導(dǎo)凋亡；C.感染球蟲，未誘導(dǎo)凋亡；D.感染球蟲，誘導(dǎo)凋亡;a，b，c，d不同表示差異顯著圖1 球蟲感染和凋亡誘導(dǎo)對Bcl-xL、Bid、Bcl-xL/Bid基因表達(dá)影響Note: A.no invasion and no apoptosis induced; B.no invasion and apoptosis induced; C.invasion and no apoptosis induced; D.invasion and apoptosis induced，a，b，c，d differences is significantFig.1 The differential expression of Bcl-xL, Bid, Bcl-xL/Bid gene under E.tenella invasion and apoptosis induced

2.2 Bid基因表達(dá)變化

與未感染球蟲未誘導(dǎo)凋亡組比較，Bid基因攻蟲凋亡誘導(dǎo)組表達(dá)下調(diào)，而未感染凋亡誘導(dǎo)組表達(dá)上調(diào)，且差異顯著(P<0.05)(圖1)。

Bcl-xL/Bid的比值攻蟲凋亡誘導(dǎo)組表達(dá)均相對上調(diào)，而未攻蟲凋亡誘導(dǎo)組表達(dá)均相對下調(diào)，且均差異顯著，(P<0.05)(圖1)。

2.3 Bcl-2基因表達(dá)變化

與未感染球蟲未誘導(dǎo)凋亡組比較，未攻蟲凋亡誘導(dǎo)組Bcl-2基因表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)，攻蟲未凋亡誘導(dǎo)組顯著上調(diào)(P<0.05)，攻蟲凋亡誘導(dǎo)組基因表達(dá)下調(diào)量略低于凋亡組(圖2)，但差異不顯著。

2.4 Bax基因表達(dá)變化

與未感染球蟲未誘導(dǎo)凋亡組比較，未感染凋亡誘導(dǎo)組Bax基因表達(dá)相對上調(diào)，攻蟲凋亡誘導(dǎo)組表達(dá)相對下調(diào)，且差異顯著(P<0.05)(圖2)。

Bcl-2/Bax的比值攻蟲凋亡誘導(dǎo)組表達(dá)均相對上調(diào)，而凋亡誘導(dǎo)組表達(dá)均相對下調(diào)，且均差異顯著，(P<0.05)(圖2)。

注：A未感染球蟲，未誘導(dǎo)凋亡；B未感染球蟲，誘導(dǎo)凋亡；C感染球蟲，未誘導(dǎo)凋亡；D感染球蟲，誘導(dǎo)凋亡a，b，c不同表示差異顯著圖2 球蟲感染和凋亡誘導(dǎo)對Bcl-2、Bax和Bcl-2/Bax基因表達(dá)影響Note: A no invasion and no apoptosis induced; B no invasion and apoptosis induced; C invasion and no apoptosis induced; D invasion and apoptosis induced，a,b,c differences is significantFig.2 The differential expression of Bcl-2，Bax和Bcl-2/Bax gene under E.tenella invasion and apoptosis induced

3 討 論

隨著細(xì)胞生物學(xué)的迅猛發(fā)展，檢測細(xì)胞凋亡的標(biāo)志物也越來越多。其中Bcl-2和Bax的比值(Bcl-2/Bax)是比較易行且同時(shí)具有代表意義，該比值能夠說明細(xì)胞發(fā)生凋亡的進(jìn)程和結(jié)局。Bcl-2與Bax基因處于細(xì)胞凋亡通路調(diào)節(jié)的上游，在正常狀態(tài)下，Bax與Bcl-2形成異源二聚體使細(xì)胞處于穩(wěn)態(tài)。當(dāng)受到凋亡信號刺激后，Bax被解離出來，形成同源二聚體從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。因此，細(xì)胞內(nèi)Bcl-2/Bax的比值是決定細(xì)胞受到某種刺激后是否發(fā)生凋亡的重要因素。雷萍等(2012)[8]研究了灰樹花提取物對脾虛小鼠脾臟Bax，Bcl-2表達(dá)的影響，證實(shí)了Bcl-2/Bax比值的提高可以抑制脾淋巴細(xì)胞的凋亡。雷博婷等(2015)[9]發(fā)現(xiàn)峨?yún)⑻崛∥餄舛鹊脑黾蛹白饔脮r(shí)間的延長，Bcl-2/Bax的比值下降，腫瘤凋亡率增加。馮全服等(2015)[10]證明川芎嗪顯著降低Bcl-2/Bax比值，誘導(dǎo)腫瘤HepG2細(xì)胞凋亡，抑制癌細(xì)胞的增殖，且呈時(shí)間劑量依賴關(guān)系。馮穎等(2015)[11]證明胰腺實(shí)性假乳頭狀瘤退變區(qū)Bcl-2/Bax比值下調(diào)，實(shí)性區(qū)Bcl-2/Bax比值上調(diào)，因此Bcl-2與Bax表達(dá)的比率決定著細(xì)胞在受到凋亡刺激信號后是生存還是凋亡, 其比例增高對凋亡有抑制作用。

在本試驗(yàn)中，與未感染球蟲未誘導(dǎo)凋亡組比較，未攻蟲凋亡誘導(dǎo)組Bcl-2基因表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)，攻蟲未凋亡誘導(dǎo)組顯著上調(diào)(P<0.05)，攻蟲凋亡誘導(dǎo)組基因表達(dá)下調(diào)量略低于凋亡組(圖1)，但差異不顯著，是由于加入凋亡誘導(dǎo)劑后Bcl-2基因表達(dá)受到抑制，使裂殖子感染早期抑制細(xì)胞凋亡。Bax基因未感染凋亡誘導(dǎo)組表達(dá)相對上調(diào)，攻蟲凋亡誘導(dǎo)組表達(dá)相對下調(diào)，且差異顯著(P<0.05)。Bcl-2/Bax的比值攻蟲凋亡誘導(dǎo)組升高，而未感染凋亡誘導(dǎo)組下降，且均差異顯著，(P<0.05)。說明裂殖子感染通過調(diào)節(jié)Bcl-2及Bax的表達(dá)量達(dá)到抑制宿主細(xì)胞凋亡的作用。

Bcl-2家族的另一對凋亡相關(guān)因子：Bcl-xl和Bid在細(xì)胞凋亡中也起著重要的作用，Bcl-xl蛋白通過抑制線粒體釋放細(xì)胞色素C(Cyto C)[12]和凋亡誘導(dǎo)因子達(dá)到抑制細(xì)胞凋亡的作用，且Bcl-xl抗凋亡作用要強(qiáng)于Bcl-2，而Bid蛋白則可以增加這兩種物質(zhì)的釋放從而促進(jìn)凋亡[13]。張蕾蕾等(2015)[14]發(fā)現(xiàn)Zeylenone誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞時(shí)Bcl-xL表達(dá)大幅下調(diào)，使其凋亡。郭文娟等(2010)[15]證實(shí)了Bcl-XL/Bid比值的降低與腺癌的發(fā)生相關(guān)，正常小腸組織中Bcl-XL/Bid比值要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于小腸腺癌組織。在死亡受體途徑中，tBid進(jìn)入線粒體，抑制Bcl-XL的表達(dá)。受到死亡信號的刺激后，胞漿中的Bid等因子會轉(zhuǎn)至線粒體上，促進(jìn)釋放Cyto C，而線粒體外膜上Bcl-2和Bcl-XL則抑制Cyto C的釋放[16]。線粒體釋放出Cyto C后，Cyto C與Apaf-1結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[6]。在本試驗(yàn)中，Bcl-XL各試驗(yàn)組基因表達(dá)相對下調(diào)，但攻蟲凋亡誘導(dǎo)組基因下調(diào)量大于未感染凋亡誘導(dǎo)組。Bid基因攻蟲凋亡誘導(dǎo)組表達(dá)下調(diào)，而未感染凋亡誘導(dǎo)組表達(dá)上調(diào)，且差異顯著(P<0.05)。Bcl-XL/Bid的比值攻蟲凋亡誘導(dǎo)組表達(dá)均相對上調(diào)，而未感染凋亡誘導(dǎo)組表達(dá)均相對下調(diào)，且均差異顯著，(P<0.05)。證明雞柔嫩艾美耳球蟲裂殖子抑制宿主細(xì)胞凋亡與Bcl-XL/Bid的比值呈正相關(guān)性。

綜上所述，裂殖子入侵后通過抑制宿主細(xì)胞Bcl-XL/Bid，Bcl-2/Bax兩對異源二聚體的解離抑制細(xì)胞凋亡。