白俊艷，時(shí)坤鵬，盧小寧，楊 帥，陳夢(mèng)柯，馬永康，鞏慧榮，董智豪，龐有志，雷 瑩，曹 慧，安肖凱，常世增，侯偉曉，付學(xué)言，樊紅燈，曹 恒

(1.河南科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，河南 洛陽 471023; 2.洛陽市動(dòng)物遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 洛陽 471023)

肌細(xì)胞生成素(Myogenin，MyoG)是一種生肌調(diào)節(jié)因子(MRFs)，與生肌決定因子(MyoD)、生肌調(diào)節(jié)因子4(MRF4)、肌細(xì)胞生成素和生肌因子5(MYF5)共同調(diào)控肌肉的生長(zhǎng)[1]。MyoD和MyoG均為肌調(diào)節(jié)蛋白，MyoD決定肌源性的發(fā)生，MyoG可誘導(dǎo)骨骼肌的末端分化[2]。WEINTRAUB等[3]研究發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)敲除MyoG基因的小鼠會(huì)因骨骼肌發(fā)育出現(xiàn)缺陷而死亡，如果同時(shí)只敲除其他3個(gè)生肌調(diào)節(jié)因子基因，小鼠骨骼肌發(fā)育都未出現(xiàn)缺陷。MyoG作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，其表達(dá)啟動(dòng)了一系列骨骼肌特異的胚胎性受體和收縮蛋白的合成。因此 ，MyoG是唯一的無可替代的生肌調(diào)節(jié)因子[4]。近年來，國(guó)內(nèi)外對(duì)MyoG基因的研究比較廣泛，多集中在生長(zhǎng)性能的關(guān)聯(lián)性、肌肉形成機(jī)制、MyoG基因的遺傳表達(dá)和調(diào)控方面[5-9]，而MyoG基因與鵪鶉的生長(zhǎng)性能的關(guān)聯(lián)分析尚未見報(bào)道。為此，利用PCR-SSCP法對(duì)MyoG基因與鵪鶉的早期生長(zhǎng)性能進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析，以期為鵪鶉的早期生長(zhǎng)性能標(biāo)記輔助選擇提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用的鵪鶉包括中國(guó)黃羽鵪鶉、北京白羽鵪鶉、朝鮮鵪鶉各80只，均來自河南省鵪鶉養(yǎng)殖基地，全部為雌性鵪鶉。翅靜脈采血0.4～1 mL，裝于肝素鈉抗凝管中，充分混勻后置于-20 ℃冰箱中保存。采用家禽全血DNA試劑盒(購(gòu)自鄭州鼎國(guó)生物有限公司)提取DNA，用0.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 MyoG基因的引物合成

MyoG基因5′調(diào)控區(qū)A、B位點(diǎn)的引物分別為MyoG-5P1、MyoG-5P2，引物設(shè)計(jì)參考王瓊等[10]的方法，由北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司進(jìn)行合成(表1)。

1.3 MyoG基因的PCR擴(kuò)增反應(yīng)

PCR反應(yīng)體系:擴(kuò)增總體積為20 μL，其中滅菌水7.6 μL、Mix 10 μL、上下游引物(10 μmol/L)各0.7 μL、DNA模板1 μL。PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性40 s，57.2 ℃或61.9 ℃退火45 s，72 ℃延伸35 s,35個(gè)循環(huán)；72 ℃再次延伸5 min。

1.4 MyoG基因的PCR-SSCP檢測(cè)

將5 μL變性上樣緩沖液(98%甲酰胺、2%甘油、10 mmol/L的EDTA、0.025%溴酚藍(lán)、0.025%二甲苯青)和5 μL的PCR產(chǎn)物混合均勻，98 ℃水浴變性10 min，立即0 ℃冰水浴10 min。制備10%的丙烯酰胺凝膠(蒸餾水24 mL，50%丙烯酰胺8 mL，5×TBE溶液8 mL，10%過硫酸銨400 μL，四甲基乙二胺40 μL)。220 V電壓條件下電泳15 min，后改為90 V電泳6 h，硝酸銀染色，將結(jié)果在燈光下拍照保存。

1.5 數(shù)據(jù)分析

利用PopGene軟件計(jì)算基因頻率、基因型頻率、雜合度(He)、有效等位基因、多態(tài)信息含量(PIC)。利用SPSS 17.0軟件對(duì)MyoG基因多態(tài)性與鵪鶉早期生長(zhǎng)性能進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，分析模型：yijkl=μ+Bi+Wj+Mk+eijkl。式中,yijkl為性狀表型值，μ為總體均值，Bi為第i個(gè)品種效應(yīng)(i=1，2，3)，Wj為第j周齡效應(yīng)(j=1，2，3，4，5，6，7)，Mk為第k種基因型效應(yīng)，eijkl為殘差效應(yīng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 鵪鶉MyoG基因5′調(diào)控區(qū)A、B位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物檢測(cè)

從圖1可以看出，鵪鶉MyoG基因5′調(diào)控區(qū)A位點(diǎn)擴(kuò)增獲得的目的片段大小為203 bp，B位點(diǎn)擴(kuò)增獲得的目的片段大小為236 bp，這與預(yù)期相一致，具有較好的特異性，可以進(jìn)行后續(xù)的試驗(yàn)。

2.2 MyoG基因5′調(diào)控區(qū)A、B位點(diǎn)在鵪鶉群體中的多態(tài)性檢測(cè)

在3個(gè)鵪鶉群體中MyoG基因5′調(diào)控區(qū)A點(diǎn)共發(fā)現(xiàn)6種基因型，分別為AA、BB、CC、AB、AC、BC基因型，其中在朝鮮鵪鶉群體中沒有發(fā)現(xiàn)AB、BC基因型(圖2)。

A為MyoG基因5′調(diào)控區(qū)A位點(diǎn)；B為MyoG基因5′調(diào)控區(qū)B位點(diǎn)；M為Marker 2000；1、2、6、7為中國(guó)黃羽鵪鶉；3、4、8、9為北京白羽鵪鶉；5、10為朝鮮鵪鶉

A為中國(guó)黃羽鵪鶉；B為北京白羽鵪鶉；C為朝鮮鵪鶉；4、12、14、17、19、23、24為AA基因型；5為AB基因型；1、3、13、20為AC基因型；7、9為BB基因型；10為BC基因型；2、6、8、11、15、16、18、21、22為CC基因型

對(duì)3個(gè)品種鵪鶉的MyoG基因5′調(diào)控區(qū)B位點(diǎn)基因型檢測(cè),結(jié)果見圖3。在3個(gè)品種鵪鶉群體中共發(fā)現(xiàn)AA、BB、CC、DD、EE、AB、AC、AD、AE等9種基因型，A、B、C、D、E等5個(gè)等位基因，其中朝鮮鵪鶉群體中缺少等位基因C。

A為中國(guó)黃羽鵪鶉；B為北京白羽鵪鶉；C為朝鮮鵪鶉；3、4、7、10、11、15、17、18、19、20、21、23為AA基因型;2為BB基因型;1、6為DD基因型;5為EE基因型;8、12、13、16為AB基因型;9、14、22為AE基因型

2.3 MyoG基因5′調(diào)控區(qū)A、B位點(diǎn)在鵪鶉群體中的遺傳多態(tài)性

從表2和表3可以看出，對(duì)于A位點(diǎn)來說，中國(guó)黃羽鵪鶉、北京白羽鵪鶉和朝鮮鵪鶉的CC基因型頻率均為最高，CC基因型頻率分別為0.323、0.366、0.444；中國(guó)黃羽鵪鶉、北京白羽鵪鶉和朝鮮鵪鶉的遺傳多樣性較為豐富(He>0.5)，3個(gè)品種鵪鶉群體都為中度多態(tài)(0.250.5)，3個(gè)品種鵪鶉群體均為高度多態(tài)(PIC>0.5)。

表2 鵪鶉MyoG基因5′調(diào)控區(qū)A位點(diǎn)和B位點(diǎn)的基因型頻率Tab.2 Genotype frequencies of A and B loci in 5′regulatory region of quail MyoG gene

表3 鵪鶉MyoG基因5′調(diào)控區(qū)A位點(diǎn)和B位點(diǎn)的等位基因頻率和多態(tài)信息含量Tab.3 Allele frequencies and polymorphic information content of A and B loci in 5′regulatory region of quail MyoG gene

2.4 MyoG基因5′調(diào)控區(qū)A、B位點(diǎn)的多態(tài)性與鵪鶉生長(zhǎng)性能的關(guān)聯(lián)分析

MyoG基因5′調(diào)控區(qū)A位點(diǎn)的多態(tài)性與蛋用鵪鶉早期生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果見表4，由于BB基因型和BC基因型個(gè)體比較少，因此,關(guān)聯(lián)分析時(shí)未考慮這2個(gè)基因型，蛋用鵪鶉早期生長(zhǎng)發(fā)育性能只對(duì)AA、AB、AC、CC這4種基因型進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。由表4可知，在體質(zhì)量、脛長(zhǎng)、胸寬、胸深、胸骨長(zhǎng)、體長(zhǎng)等性狀上，AB基因型顯著高于AA、AC、CC基因型(P<0.05)，AA、AC、CC基因型個(gè)體間不存在顯著性差異(P>0.05)。脛圍在AA、AB、AC、CC基因型間無顯著性差異(P>0.05)。

表4 MyoG基因5′調(diào)控區(qū)A位點(diǎn)與鵪鶉早期生長(zhǎng)性能的關(guān)聯(lián)分析Tab.4 Association of 5′regulatory region A site of MyoG gene of quail with early growth and development

注：同行數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note: The different lowercase letters in the same row mean significant difference (P<0.05).

MyoG基因5′調(diào)控區(qū)B位點(diǎn)的多態(tài)性與蛋用鵪鶉早期生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果見表5。由于AC、CE、BD基因型個(gè)體比較少，關(guān)聯(lián)分析時(shí)未考慮這3個(gè)基因型。從表5可以看出，CC基因型體質(zhì)量顯著高于AD、AE、BB、DD基因型(P<0.05)，DD基因型的體質(zhì)量最低。CC基因型脛長(zhǎng)顯著高于AA、AD、AE、BB、DD基因型(P<0.05)。CC基因型胸寬顯著高于其他基因型(P<0.05)。CC基因型胸深顯著高于其他基因型(P<0.05)。CC基因型胸骨長(zhǎng)顯著高于AA、AB、AD、AE、BB、DD、EE基因型(P<0.05)，AA、AB、EE基因型胸骨長(zhǎng)顯著高于AD、AE、DD基因型(P<0.05)。CC、EE基因型體長(zhǎng)顯著高于AD、AE基因型和DD基因型(P<0.05)。

表5 MyoG基因5′調(diào)控區(qū)B位點(diǎn)與鵪鶉早期生長(zhǎng)性能的關(guān)聯(lián)分析Tab.5 Association of 5′ regulatory region B site of MyoG gene of quail with early growth and development

注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note:The different lowercase letters in the same column mean significant difference(P<0.05).

3 結(jié)論與討論

3.1 MyoG基因的多態(tài)性

在禽類研究中，趙忠海等[11]在三穗鴨MyoG基因的外顯子1、2、3中分別發(fā)現(xiàn)了1個(gè)、2個(gè)和3個(gè)突變位點(diǎn)。王瓊[12]在肉雞的MyoG5′調(diào)控區(qū)A位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)了1個(gè)突變位點(diǎn)，共3種基因型，B位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)了3個(gè)SNPs位點(diǎn)，共6種基因型。魏岳等[13]在邊雞的MyoG基因第3外顯子中發(fā)現(xiàn)了2處突變位點(diǎn)，共6種基因型。唐瑩等[14]在京海黃雞的MyoG基因外顯子1上共發(fā)現(xiàn)了3種基因型?？梢姡琈yoG基因在禽類中存在豐富的多態(tài)性。本研究中，使用MyoG基因5′調(diào)控區(qū)A、B位點(diǎn)在3個(gè)品種的鵪鶉群體中進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè)，A位點(diǎn)中出現(xiàn)了6種基因型；在B位點(diǎn)中檢測(cè)到了9種基因型。可見，MyoG基因在鵪鶉群體中存在豐富的多態(tài)性。

3.2 MyoG基因的多態(tài)性與生長(zhǎng)性能的關(guān)聯(lián)分析

關(guān)于MyoG基因與生長(zhǎng)性能關(guān)系的研究大多集中在豬上，在禽類中也有少量的研究。在MyoG多態(tài)性與禽類生長(zhǎng)性能關(guān)聯(lián)性的研究中，趙忠海等[11]研究發(fā)現(xiàn)，MyoG基因的2種突變分別對(duì)鴨的胸肌率、體質(zhì)量和全凈膛質(zhì)量有顯著影響，其所對(duì)應(yīng)的純合子基因型 CC、GG型為優(yōu)勢(shì)基因。王瓊[12]發(fā)現(xiàn)，MyoG基因?qū)﹄u的肌纖維生長(zhǎng)發(fā)育有顯著影響。魏岳等[13]在MyoG基因上發(fā)現(xiàn)2處同義突變位點(diǎn)，MyoG基因在胸肌中的表達(dá)量極顯著高于腿肌。唐瑩等[14]在京海黃雞的MyoG基因外顯子1上共發(fā)現(xiàn)了3種基因型，分別為 AA、AB、BB，BB基因型的2、4、6周齡體質(zhì)量顯著高于 AB基因型(P<0.05)， BB基因型的8周齡體質(zhì)量顯著高于 AA基因型(P<0.05)。王瓊[12]在肉雞的MyoG5′調(diào)控區(qū)A位點(diǎn)和B位點(diǎn)都發(fā)現(xiàn)了基因的多態(tài)性與肉雞的屠宰性存在顯著的相關(guān)性(P<0.05)，其中B位點(diǎn)的多態(tài)性與雞的肌纖維發(fā)育存在顯著的正相關(guān)。魏岳等[13]研究發(fā)現(xiàn)，MyoG基因的多態(tài)性對(duì)邊雞生長(zhǎng)發(fā)育性能和屠宰性能表現(xiàn)出顯著或極顯著的影響(P<0.05或P<0.01)。唐瑩等[14]研究發(fā)現(xiàn)，MyoG基因外顯子1的多態(tài)性與京海黃雞早期生長(zhǎng)發(fā)育性能存在顯著的相關(guān)性(P<0.05)。

在MyoG基因5′調(diào)控區(qū)A位點(diǎn)的多態(tài)性與鵪鶉生長(zhǎng)性能關(guān)聯(lián)的研究中，AB基因型的蛋用鵪鶉在體質(zhì)量、脛長(zhǎng)、胸寬、胸深、胸骨長(zhǎng)、體長(zhǎng)等早期生長(zhǎng)發(fā)育性狀上都顯著性高于AA、AC和CC基因型(P<0.05)。在MyoG基因5′調(diào)控區(qū)B位點(diǎn)的多態(tài)性與鵪鶉生長(zhǎng)性能關(guān)聯(lián)的研究中，蛋用鵪鶉在體質(zhì)量、脛長(zhǎng)、胸寬、胸深、胸骨長(zhǎng)、體長(zhǎng)、等多個(gè)早期生長(zhǎng)發(fā)育性狀上都出現(xiàn)了顯著性差異(P<0.05)。MyoG基因5′調(diào)控區(qū)A、B位點(diǎn)的多態(tài)性與鵪鶉早期生長(zhǎng)發(fā)育性能存在關(guān)聯(lián)性，這與王瓊[12]、魏岳等[13]、唐瑩等[14]的研究結(jié)果相似。早期生長(zhǎng)性能與MyoG基因5′調(diào)控區(qū)B位點(diǎn)的多態(tài)性存在關(guān)聯(lián)，但由于基因型較多，還不能確定優(yōu)勢(shì)基因型，需要后續(xù)進(jìn)一步研究。綜上，MyoG基因5′調(diào)控區(qū)A、B位點(diǎn)關(guān)聯(lián)分析顯示，不同基因型與早期蛋用鵪鶉的體質(zhì)量、脛長(zhǎng)、胸寬、胸深、胸骨長(zhǎng)、體長(zhǎng)存在關(guān)聯(lián)性，且差異顯著(P<0.05)，說明MyoG基因5′調(diào)控區(qū)A、B位點(diǎn)對(duì)鵪鶉的早期生長(zhǎng)性能有一定影響。