閆 敏，王 晗，劉少華，顧小敏，許 曄

(江蘇第二師范學(xué)院 生命科學(xué)與化學(xué)化工學(xué)院，江蘇 南京 211200)

小G蛋白是一類單體GTP結(jié)合蛋白，具有GTP酶活性，分子質(zhì)量介于21～30 ku，其結(jié)構(gòu)與功能類似于異三聚體G蛋白中的α亞基[1]。植物中的Rho GTPase被稱為ROP(Rho-related GTPase from plants)家族。ROP蛋白的結(jié)構(gòu)極為保守，主要包含與鳥苷酸結(jié)合有關(guān)的5個(gè)G結(jié)構(gòu)域、1個(gè)效應(yīng)因子結(jié)合點(diǎn)、1個(gè)插入序列和C端可變區(qū)。其中，G結(jié)構(gòu)域和效應(yīng)因子結(jié)合點(diǎn)決定ROP蛋白的功能，C端可變區(qū)與蛋白質(zhì)定位相關(guān)，而插入序列的功能目前尚不清楚[2]。擬南芥中有11個(gè)ROP基因，相似性很高。根據(jù)擬南芥ROP蛋白序列的相似性及C端可變區(qū)將其分為4類：第Ⅰ類包括ROP8；第Ⅱ類包括ROP9、ROP10、ROP11；第Ⅲ類包括ROP7；第Ⅳ類包括ROP1至ROP6[3]。

近年來的研究發(fā)現(xiàn)，植物小G蛋白R(shí)OP參與調(diào)控植物生命活動(dòng)的眾多生理過程，包括花粉管的生長(zhǎng)[4]、根毛的發(fā)育[5]、表皮細(xì)胞的極性擴(kuò)張生長(zhǎng)[6]、激素的應(yīng)答[7]、植物的逆境脅迫[8]和防御反應(yīng)[9]等，發(fā)揮重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。例如，擬南芥持續(xù)激活型ROP1(Constitutively activeROP1,CA-ROP1)過表達(dá)植株的花粉管頂端發(fā)育異常，膨大呈球狀，而負(fù)顯性ROP1(Dominant negativeROP1,DN-ROP1)過表達(dá)會(huì)抑制花粉管的生長(zhǎng)[4]。ROP1位于花粉管頂端細(xì)胞的質(zhì)膜上，ROP1激活RIC3(ROP interactive CRIB-containing protein 3)誘導(dǎo)花粉管頂端Ca2+濃度的增加并導(dǎo)致微絲的解聚，同時(shí)ROP1激活RIC4卻促進(jìn)微絲的聚合，ROP1通過這2個(gè)信號(hào)通路共同調(diào)控花粉管的極性生長(zhǎng)[10]。擬南芥CA-ROP2過表達(dá)會(huì)增加根毛的長(zhǎng)度和密度[5]，PLP(PLURIPETALA)和 PAT4(ProteinS-acyl transferase 4)可影響質(zhì)膜ROP2的分布，參與調(diào)控根毛的生長(zhǎng)[11-12]。MAP18(Microtubule-associated protein 18)可結(jié)合并刺激ROP2活性的增加，影響根毛尖端的生長(zhǎng)[13]。ROP發(fā)揮不同的生理功能，同時(shí)一些ROP也存在一定程度的功能冗余。在擬南芥葉片表皮細(xì)胞的凸起區(qū)，ROP2可激活RIC4促進(jìn)微絲的組裝，同時(shí)ROP2抑制RIC1與周質(zhì)微管的結(jié)合，從而促進(jìn)細(xì)胞的擴(kuò)張[6]。進(jìn)一步的研究表明，凹陷區(qū)的ROP6通過激活RIC1促進(jìn)微管的形成，抑制凹陷區(qū)細(xì)胞的側(cè)向擴(kuò)張[14]。由此可見，ROP2和ROP6通過2條相互拮抗的信號(hào)途徑來調(diào)控?cái)M南芥表皮細(xì)胞的極性擴(kuò)張生長(zhǎng)[15]。SPK1(SPIKE1)能夠激活ROP，包括ROP2、ROP4和ROP6，調(diào)控花瓣表皮細(xì)胞的各向異性生長(zhǎng)，進(jìn)而影響花瓣的生長(zhǎng)發(fā)育[16]。擬南芥CA-ROP2和CA-ROP11過表達(dá)植株的葉片呈明顯向下卷曲形態(tài)，表皮細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生改變[17-18]。此外，研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥中被激活的ROP2通過抑制RIC1調(diào)控微管動(dòng)態(tài)變化，提高了植物對(duì)鹽脅迫的耐受能力[8]，過表達(dá)香蕉MaROP5g也會(huì)增加植物的耐鹽性[19]，表明ROP在植物抗鹽脅迫中發(fā)揮重要作用。

目前，已從擬南芥[1]、水稻[20]、玉米[21]、煙草[22]、葡萄[23]、苜蓿[24]、香蕉[19]等植物中分離獲得了多個(gè)ROP蛋白，其中擬南芥中有11個(gè)ROP基因家族成員，水稻中有7個(gè)，玉米中有9個(gè)[25]，香蕉中有17個(gè)。而關(guān)于大白菜(Brassicarapassp.pekinensis)ROP基因家族及其功能的研究鮮見報(bào)道。大白菜是我國(guó)分布最廣、栽培面積最大、產(chǎn)量最高、最大眾化的蔬菜品種之一，在我國(guó)居民生活中具有非常重要的地位。大白菜(Chiifu-401-42)全基因組測(cè)序的完成使得對(duì)大白菜中相關(guān)基因家族的鑒定和功能分析成為可能[26]。本研究利用生物信息學(xué)方法對(duì)大白菜BrROP基因家族成員進(jìn)行鑒定和基因組注釋，并對(duì)其基因結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)序列、保守結(jié)構(gòu)域、進(jìn)化關(guān)系和表達(dá)模式等進(jìn)行系統(tǒng)分析，為今后開展大白菜BrROP基因家族的生物功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 大白菜BrROP基因家族的鑒定

通過TAIR(http://arabidopsis.org/)下載擬南芥ROP基因家族的氨基酸序列，與白菜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(http://brassicadb.org/brad/)中的大白菜氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，以E≤10-10的序列作為候選序列，獲得大白菜BrROP基因。利用NCBI的保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/structure/cdd/wrpsb.cgi)分析候選蛋白的保守結(jié)構(gòu)域以驗(yàn)證大白菜BrROP基因家族鑒定的準(zhǔn)確性。

1.2 大白菜BrROP基因的染色體定位

通過白菜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)獲得大白菜BrROP基因的CDS序列和基因組信息，根據(jù)BrROP基因在染色體上的精確位置和染色體的長(zhǎng)度，利用MG2C(Map Gene2 chromosome V2,http://mg2c.iask.in/mg2c_v2.0/)在線分析軟件將所有BrROP基因定位到對(duì)應(yīng)的染色體上。

1.3 大白菜BrROP蛋白的生理生化分析

用蛋白質(zhì)分析軟件ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)對(duì)BrROP蛋白序列進(jìn)行分析，得到BrROP蛋白的分子質(zhì)量、等電點(diǎn)、氨基酸數(shù)目等參數(shù)信息。

1.4 大白菜BrROP基因結(jié)構(gòu)、保守結(jié)構(gòu)域和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

利用在線GSDS(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)軟件對(duì)BrROP基因的外顯子和內(nèi)含子進(jìn)行分析。利用DNAMAN軟件對(duì)BrROP蛋白的氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)。利用在線MEME (http://meme-suite.org/tools/meme)軟件鑒定大白菜BrROP蛋白的保守結(jié)構(gòu)域。

通過ClustalW軟件對(duì)大白菜和擬南芥ROP蛋白的氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)，將多序列比對(duì)結(jié)果運(yùn)用MEGA 5.0軟件采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，設(shè)置Bootstrap進(jìn)行1 000次抽樣，其他參數(shù)為默認(rèn)值。

1.5 大白菜BrROP基因的表達(dá)部位分析

通過EMBL-EBI數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ebi.ac.uk/gxa/home)檢索獲得BrROP家族基因在大白菜根、莖、葉、花、角果等組織中的表達(dá)數(shù)據(jù)。利用MeV4.9軟件繪制基因表達(dá)圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 大白菜BrROP基因家族的鑒定結(jié)果

利用擬南芥ROP蛋白的氨基酸序列，在大白菜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行搜索比對(duì)，以E≤10-10作為候選標(biāo)準(zhǔn)，共鑒定到22個(gè)大白菜BrROP基因家族成員，并按照擬南芥同源序列命名法將其命名。如表1所示，這22個(gè)BrROP基因中長(zhǎng)度最短的為BrROP3-3(528 bp)，最長(zhǎng)的為BrROP11-1(648 bp)，編碼的氨基酸序列長(zhǎng)度為175～215 aa，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量在19.11～23.88 ku。大白菜BrROP蛋白的等電點(diǎn)為8.96～9.61，均大于7，說明該家族成員富含堿性氨基酸。

表1 大白菜BrROP基因家族成員基本信息Tab.1 Basic information of BrROP gene family members in Brassica rapa

利用MG2C在線分析軟件將BrROP基因定位到對(duì)應(yīng)的染色體上，如圖1所示，除第4、10號(hào)染色體上沒有基因分布外，22個(gè)BrROP基因在其余8條染色體上呈不均勻分布，未發(fā)現(xiàn)串聯(lián)重復(fù)基因。其中，第7號(hào)染色體上分布基因數(shù)量最多，含有5個(gè)BrROP基因；第1號(hào)染色體上分布4個(gè)BrROP基因；第2、9號(hào)染色體上分別分布3個(gè)BrROP基因；第3、6號(hào)染色體上分別分布2個(gè)BrROP基因；第5、8號(hào)染色體上分別分布1個(gè)BrROP基因。此外，BrROP3-3分布在Scaffold 000289上，沒有定位到相應(yīng)的染色體。

2.2 大白菜BrROP基因結(jié)構(gòu)分析

從白菜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中下載基因組和CDS序列信息，運(yùn)用在線GSDS軟件對(duì)BrROP基因的外顯子和內(nèi)含子進(jìn)行分析(圖2)，結(jié)果顯示，大白菜BrROP家族成員基因結(jié)構(gòu)相似性較高，均含有6～8個(gè)外顯子。其中BrROP11-1基因最多，含有8個(gè)外顯子，15個(gè)BrROP基因(BrROP2-1、BrROP2-2、BrROP3-1、BrROP3-2、BrROP4-1、BrROP4-2、BrROP4-3、BrROP6-1、BrROP6-2、BrROP7-1、BrROP7-2、BrROP8、BrROP9、BrROP11-2和BrROP11-3)均含有7個(gè)外顯子，而6個(gè)BrROP基因(BrROP1-1、BrROP1-2、BrROP1-3、BrROP3-3、BrROP5-1和BrROP5-2)則含有6個(gè)外顯子。

圖1 大白菜BrROP基因的染色體定位Fig.1 Chromosomal distribution of BrROP genes in Brassica rapa

圖2 大白菜BrROP基因的結(jié)構(gòu)Fig.2 The structure of BrROP genes in Brassica rapa

2.3 大白菜BrROP蛋白的保守結(jié)構(gòu)域分析

利用DNAMAN軟件對(duì)大白菜BrROP蛋白的氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)(圖3)，分析表明，大白菜BrROP蛋白結(jié)構(gòu)較保守，主要包含與鳥苷酸結(jié)合有關(guān)的5個(gè)G結(jié)構(gòu)域(G1—G5)、1個(gè)效應(yīng)因子結(jié)合點(diǎn)(Effector binding)、1個(gè)插入序列(Rho insert)和C端可變區(qū)(HVR)。以BrROP1-1為例，如果將BrROP1-1蛋白G1中的第15位甘氨酸(G)突變?yōu)槔i氨酸(V)或G3中的第64位谷氨酰胺(Q)突變?yōu)榱涟彼?L)，BrROP1-1則成為持續(xù)激活型形式(Constitutively active BrROP1-1,CA-BrROP1-1)。如果將BrROP1-1蛋白G1中的第20位蘇氨酸(T)突變?yōu)樘於０?N)或G4中的第121位天冬氨酸(D)突變?yōu)楸彼?A)，BrROP1-1則成為顯性失活形式(Dominant negative BrROP1-1,DN-BrROP1-1)。此外，利用MEME在線分析軟件對(duì)大白菜BrROP蛋白進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，檢測(cè)到10個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域(圖4)。結(jié)果表明，除BrROP3-3中不存在Motif 3外，其余BrROP均具有Motif 1—6。

圖3 大白菜BrROP蛋白的氨基酸序列多重比對(duì)Fig.3 Mutiple alignment of the amino acid sequences of BrROP proteins in Brassica rapa

圖4 大白菜BrROP蛋白的保守結(jié)構(gòu)域分布Fig.4 Distribution of conserved motifs of BrROP proteins in Brassica rapa

2.4 大白菜BrROP基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用ClustalW軟件對(duì)大白菜和擬南芥ROP蛋白的氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)，將多序列比對(duì)結(jié)果運(yùn)用MEGA 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹并進(jìn)行聚類分析(圖 5)。結(jié)果表明，根據(jù)擬南芥AtROP基因的分類，可將22個(gè)大白菜BrROP基因分成4類，GroupⅠ、GroupⅡ、Group Ⅲ和Group Ⅳ。其中GroupⅠ包含BrROP8基因，GroupⅡ包含4個(gè)BrROP基因(BrROP9、BrROP11-1、BrROP11-2和BrROP11-3)，GroupⅢ包含2個(gè)BrROP基因(BrROP7-1和BrROP7-2)，Group Ⅳ包含15個(gè)BrROP基因(BrROP1-1、BrROP1-2、BrROP1-3、BrROP2-1、BrROP2-2、BrROP3-1、BrROP3-2、BrROP3-3、BrROP4-1、BrROP4-2、BrROP4-3、BrROP5-1、BrROP5-2、BrROP6-1和BrROP6-2)。

圖5 大白菜和擬南芥ROP基因的進(jìn)化分析Fig.5 Phylogenetic analysis of ROP genes between Brassica rapa and Arabidopsis thaliana

2.5 大白菜BrROP基因的表達(dá)部位分析

通過EMBL-EBI數(shù)據(jù)庫(kù)檢索獲得BrROP家族基因在大白菜根、莖、葉、花、角果等組織中的表達(dá)數(shù)據(jù)并進(jìn)行分析(圖6)。結(jié)果表明，BrROP1-2在花和角果中表達(dá)量較高；BrROP7-1、BrROP7-2、BrROP8在根中表達(dá)量較高；BrROP9在根、莖、角果中表達(dá)量較高；而BrROP2-1、BrROP3-1、BrROP4-1、BrROP4-2、BrROP6-1、BrROP6-2、BrROP11-1和BrROP11-3在所有組織中均具有較強(qiáng)的表達(dá)。

圖6 大白菜BrROP基因在不同組織器官中的表達(dá)Fig.6 Expression of BrROP genes in various tissues and organs of Brassica rapa

3 結(jié)論與討論

本研究根據(jù)擬南芥ROP蛋白的氨基酸序列，通過對(duì)大白菜數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行搜索比對(duì)，共鑒定到22個(gè)大白菜BrROP基因家族成員。大白菜BrROP基因結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)序列、保守結(jié)構(gòu)域、進(jìn)化關(guān)系和表達(dá)模式等分析表明，大白菜BrROP基因家族成員在基因結(jié)構(gòu)和氨基酸序列上較保守。擬南芥中含有11個(gè)ROP基因，而大白菜中含有22個(gè)BrROP基因，說明大白菜BrROP基因家族產(chǎn)生了很大的擴(kuò)張。大白菜基因組發(fā)生了全基因組三倍化事件，基于三倍化假說，大白菜基因數(shù)應(yīng)為擬南芥同源基因的3倍[27]。然而，在對(duì)大白菜BrROP基因的進(jìn)化分析中發(fā)現(xiàn)，很多大白菜BrROP基因不符合三倍化假說，與AtROP2、AtROP5、AtROP6和AtROP7同源的大白菜BrROP基因各有2個(gè)，與AtROP8、AtROP9同源的大白菜BrROP基因僅有1個(gè)，而與AtROP10同源的大白菜BrROP基因發(fā)生丟失，這可能與大白菜在三倍化過程中發(fā)生大規(guī)模的基因丟失和染色體重排有關(guān)。

大白菜屬于甜土植物，卻有一定的耐鹽性，能夠在100 mmol/L NaCl條件下生長(zhǎng)發(fā)育，并能完成生活史[28]。近些年，白菜類蔬菜耐鹽相關(guān)的一些基因被發(fā)現(xiàn)和鑒定，包括膽堿氧化酶基因(Choline oxidase,CodA)[29]、胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白基因(Late embryogenesis abundant,LEA4-1)[30]、光周期途徑成花關(guān)鍵基因(GIGANTEA,GI)[31]等，然而關(guān)于大白菜耐鹽的分子調(diào)控機(jī)制研究尚淺。因此研究和挖掘大白菜耐鹽脅迫基因，了解大白菜耐鹽脅迫的分子調(diào)控機(jī)制，對(duì)培育大白菜耐鹽品種、高效利用鹽堿地、提高農(nóng)業(yè)生產(chǎn)力具有重要意義。

擬南芥rop2突變體對(duì)鹽敏感，而CA-ROP2過表達(dá)植株的耐鹽性增強(qiáng)。研究證明，鹽脅迫會(huì)激活ROP2，激活型的ROP2能夠抑制RIC1作用于微管，使細(xì)胞中的微管在響應(yīng)鹽脅迫信號(hào)進(jìn)行解聚之后能夠順利地重新聚合，進(jìn)而提高植物的耐鹽性[8]。此外，研究發(fā)現(xiàn)，香蕉MaROP5g也可通過SOS(Salt overly sensitive)和Ca2+信號(hào)途徑參與調(diào)控植物的耐鹽性[19]。本研究對(duì)大白菜BrROP基因家族進(jìn)行鑒定和生物信息學(xué)分析，為后續(xù)研究大白菜BrROP基因在鹽脅迫應(yīng)答過程中的功能奠定了基礎(chǔ)。