張書琳，劉文文，何愛玲，崔圣瑩

（1.山東第一醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，山東 泰安 271000；2.山東第一醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山東 泰安 271000；3.泰山療養(yǎng)院檢驗(yàn)科，山東 泰安 271000；4.山東第一醫(yī)科大學(xué)教務(wù)處,山東 泰安 271000）

近年來，染發(fā)已成為人們的一種時(shí)尚選擇。大部分男性留短發(fā)，其染發(fā)的頻率要高于女性。部分有染發(fā)習(xí)慣的男性會(huì)每隔15～30 d染發(fā)1次。目前，市售染發(fā)劑主要可分為永久染發(fā)劑、半永久染發(fā)劑、脫色染發(fā)劑、臨時(shí)染發(fā)劑四大類。這些染發(fā)劑的染色原理不盡相同，但其主要成分均為對(duì)苯二胺(PPD)與雙氧水(H2O2)。這兩種成分的混合物對(duì)人體內(nèi)的多種細(xì)胞均具有致畸變的作用。除此之外，染發(fā)劑中還含有鉛等有害物質(zhì)。流行病學(xué)調(diào)查顯示，多種疾病的發(fā)生均可能與使用染發(fā)劑有關(guān)。相關(guān)的研究指出，染發(fā)劑可能對(duì)人體內(nèi)的生殖細(xì)胞產(chǎn)生致畸變作用，從而影響生育。為了探討長(zhǎng)期使用染發(fā)劑對(duì)生殖功能的危害，筆者進(jìn)行了有關(guān)染發(fā)劑致小鼠精子畸形的研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取30只SPF級(jí)昆明種健康成年雄性小鼠（由山東第一醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，周齡為6～7周，體重為20～25 g）作為研究對(duì)象。將其飼養(yǎng)于獨(dú)立的通風(fēng)換氣籠中，并將換氣籠中的溫度控制在20～25℃之間，將換氣籠中的濕度控制在50%～70%之間）。本研究經(jīng)山東第一醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2 儀器、試劑和染發(fā)劑 本研究中所用的儀器、試劑和染發(fā)劑主要包括：恒溫水浴箱（購(gòu)自天津市惠達(dá)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）、顯微鏡（購(gòu)自北京瑞宏誠(chéng)科技有限公司）、血細(xì)胞計(jì)數(shù)板（購(gòu)自北京瑞宏誠(chéng)科技有限公司）、凡士林（購(gòu)自東莞康爾維醫(yī)藥科技有限公司）、伊紅染料（購(gòu)自河北博海生物工程開發(fā)有限公司）、甲醇（購(gòu)自衡水廣康商貿(mào)有限公司）、生理鹽水（購(gòu)自衡水廣康商貿(mào)有限公司）、植物永久性染發(fā)劑（由廣州某化妝品公司生產(chǎn)，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)妝特字G20120404）、氧化永久性染發(fā)劑（由廣州某化妝品公司生產(chǎn)，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)妝特字G20121106）。

1.2 染毒方法

采用完全隨機(jī)法將上述30只小鼠分為植物永久性染發(fā)劑組、氧化永久性染發(fā)劑組和對(duì)照組。為植物永久性染發(fā)劑組小鼠、氧化永久性染發(fā)劑組小鼠分別用植物永久性染發(fā)劑、氧化永久性染發(fā)劑進(jìn)行染毒。方法是：按染發(fā)劑說明書中的配制方法配制染發(fā)劑，然后將其均勻地涂抹于小鼠的背部（涂抹面積為3 cm×3 cm）。染毒劑量為5 mg/g，每隔2 d染毒1次，連續(xù)染毒7次。為對(duì)照組小鼠在背部涂抹等量的凡士林，涂抹方法與上述染毒方法相同。

1.3 精子畸形率的測(cè)定方法

將三組小鼠于首次染毒或涂抹凡士林后的第30 d用頸椎脫臼法處死，剖開其腹腔，暴露其睪丸，分離其雙側(cè)附睪。然后將附睪標(biāo)本放入盛有4 ml溫度為37℃生理鹽水的小平皿中。將小平皿置于37℃的恒溫水浴箱中（放置時(shí)間為20 min），使精子充分游離于生理鹽水中，形成精子懸液。然后取適量的精子懸液置于載玻片的一側(cè)，取另一片載玻片為推片，制作精子涂片。待涂片干燥后，將其放入甲醇溶液中固定5 min，然后取出晾干。用2%的伊紅水溶液對(duì)涂片進(jìn)行15～20 min的染色，再用蒸餾水對(duì)其進(jìn)行沖洗。在顯微鏡下對(duì)每組小鼠精子涂片上的500個(gè)精子進(jìn)行觀察，并統(tǒng)計(jì)其中畸形精子的數(shù)量。精子畸形的主要類型包括：胖頭、尾折疊、無鉤、香蕉形、無定形、雙頭及雙尾等。無尾精子、頭部重疊或整個(gè)重疊的精子均不計(jì)數(shù)。精子的畸形率=精子畸形數(shù)/500×100%。

1.4 精子計(jì)數(shù)的測(cè)定方法

分別取每只小鼠的精子懸液10 μl，將其滴入血細(xì)胞計(jì)數(shù)板中。使精子懸液緩慢地流入計(jì)數(shù)室內(nèi)。靜置5 min后將計(jì)數(shù)板放于顯微鏡的載物臺(tái)上，待精子不再游動(dòng)后計(jì)數(shù)。在低倍鏡下找到計(jì)數(shù)室的中央大方格后，在高倍鏡下對(duì)每個(gè)計(jì)數(shù)室中左上、左下、中央、右上、右下大方格內(nèi)的精子進(jìn)行計(jì)數(shù)，再求得每個(gè)大方格中精子的均數(shù)，最后得出小鼠每毫升精液中的精子數(shù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0軟件分析本研究中的數(shù)據(jù)，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用百分比（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組小鼠的一般情況

三組小鼠在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間精神活動(dòng)狀態(tài)無異常，體重均有所增加。三組小鼠體重增長(zhǎng)的幅度相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

2.2 三組小鼠精子畸形的情況

植物永久性染發(fā)劑組小鼠和氧化永久性染發(fā)劑組小鼠精子的畸形率均高于對(duì)照組小鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。植物永久性染發(fā)劑組小鼠與氧化永久性染發(fā)劑組小鼠精子的畸形率相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。詳情見表1。

表1 三組小鼠精子畸形的情況

2.3 三組小鼠的精子計(jì)數(shù)

三組小鼠的精子計(jì)數(shù)相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。詳情見表2。

表2 三組小鼠的精子計(jì)數(shù)（×106/ml，）

表2 三組小鼠的精子計(jì)數(shù)（×106/ml，）

分組 只數(shù) 精子計(jì)數(shù)植物染發(fā)劑組 10 11.62±3.05氧化染發(fā)劑組 10 9.21±2.74對(duì)照組 10 13.36±5.48

3 討論

近年來，隨著染發(fā)劑的廣泛使用，有關(guān)染發(fā)劑毒性的研究報(bào)道逐年增多。有很多專家學(xué)者對(duì)染發(fā)劑致小鼠精子畸形的作用進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究。王麗麗等[1]研究發(fā)現(xiàn)，用氧化型染發(fā)劑對(duì)小鼠進(jìn)行染毒處理會(huì)增加其精子的畸形率。吳雨龍等[2]的研究證實(shí)，氧化型染發(fā)劑對(duì)雄性小白鼠的精子具有致畸變的作用。相關(guān)的流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，卵巢癌、膀胱癌的發(fā)生與患者長(zhǎng)期使用染發(fā)劑存在一定的關(guān)聯(lián)性[3]。精子畸形是指精子的形態(tài)異常。精子的畸形率與精子計(jì)數(shù)是反映精液質(zhì)量的重要指標(biāo)。精子畸形率的增加與精子計(jì)數(shù)的減少是雄性小鼠生殖功能受損的重要特征之一。有研究指出，經(jīng)染發(fā)劑染毒處理后的小鼠其精子畸形的主要類型包括胖頭、尾折疊、無鉤、香蕉形、無定形、雙頭及雙尾等[4]。其中尾折疊畸形最為常見，其次為胖頭畸形，而雙頭及雙尾畸形則較為少見[5-6]。本研究的結(jié)果顯示，植物永久性染發(fā)劑組小鼠和氧化永久性染發(fā)劑組小鼠精子的畸形率均高于對(duì)照組小鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

綜上所述，用植物永久性染發(fā)劑和氧化永久性染發(fā)劑對(duì)小鼠進(jìn)行染毒處理均會(huì)增加其精子的畸形率。