梁春艷

四川省涼山彝族自治州攀鋼西昌醫(yī)院普通外科(四川 615000)

近年來，關于二氫丹參酮Ⅰ與惡性腫瘤的研究文獻報道越來越多，涉及的惡性腫瘤有胃癌[1]、結直腸癌[2- 4]、乳腺癌[5]、宮頸癌[6]、骨肉瘤[7]、白血病[8]、等等，也有癌腫瘤細胞移植瘤體外模型實驗研究[7-10]。從報道的文獻來分析，二氫丹參酮Ⅰ抗腫瘤活性存在很多可能的通路以及機制：活化JNK/P38通路[1]、阻斷tnf-α誘導的nf-kappab信號通路[11]等、抑制癌細胞增殖[9]、誘導癌細胞周期阻滯[12]、抑制癌細胞轉移和侵襲[7]、誘導癌細胞凋亡[9，13]等。

前期我們的細胞試驗研究表明，二氫丹參酮Ⅰ通過活性氧介導的氧化應激反應誘導胃癌AGS 細胞凋亡[14]。這僅僅是細胞學上觀察到的現(xiàn)象。二氫丹參酮Ⅰ抗胃癌潛在機制尚未完全清晰?；诖四康?，本研究嘗試運用GEPIA數據庫，提供包括TCGA數據庫和GTEx數據庫的功能，探索性地研究二氫丹參酮Ⅰ通過氧化應激作用胃癌可能潛在靶點：潛在靶點與抗氧化應激反應相關性分析、該潛在靶點在胃癌患者差異表達分析以及其生存分析，包括總生存率(OS)和無瘤生存率(DFS)。尋找二氫丹參酮Ⅰ通過氧化應激反應作用于胃癌候選潛在藥物靶點，為診斷和識別胃癌、治療胃癌提供生物標志物鋪下基礎理論。

1 資料與方法

1.1 在數據庫檢索二氫丹參酮Ⅰ作用胃癌AGS細胞潛在靶點研究的文獻

在PubMed、中國知網(CNKI)等數據庫(2019年3月12日前)中進行檢索，以查詢所有公開已發(fā)表的研究二氫丹參酮Ⅰ作用于胃癌靶點的文獻。使用檢索詞“gastric cancer”、“gastric neoplasms”、“malignant tumors of stomach”、“dihydrotanshinone”、“dihydrotanshinoneⅠ”、“DHTS”、“DHT”、“dht”、“dhts”、“DI”，中文使用“胃癌”、“胃腫瘤”、“胃惡性腫瘤”、“胃腫瘤惡變”，以及“丹參酮”、“二氫丹參酮”、“二氫丹參酮Ⅰ”“丹參”，進行檢索。

從檢索結果的文獻題目中初步篩選符合二氫丹參酮作用胃癌潛在靶點的文獻，然后閱讀文獻摘要以及全文，決定選取的文獻。根據文獻內容，仔細深入判讀二氫丹參酮作用胃癌靶點是上游的靶點還是下游的靶點。如果不能正確做出抉擇時，翻閱專業(yè)文獻研究結果以及請生物化學等相關專業(yè)教授學者協(xié)助做出取舍。

1.2 GEPIA數據庫工具分析二氫丹參酮Ⅰ作用胃癌AGS細胞潛在機制

Gene Expression Profiling Interactive Analysis數據庫(簡稱GEPIA數據庫)，中文一般稱該數據庫為癌癥和正?；虮磉_分析和交互分析網絡數據庫，包含9 736腫瘤和8 587例正常樣本的TCGA和GTEX的數據，用以分析RNA序列表達。

1.2.1 潛在靶點基因和表達抗氧化應激關鍵蛋白的基因的相關性分析

根據檢索文獻報道二氫丹參酮Ⅰ作用胃癌所有靶點，并在PubMed數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed)檢索這些靶點蛋白對應的人基因。文獻檢索抗氧化應激關鍵基因。在文獻檢索抑制氧化應激的重要調節(jié)蛋白，然后將此蛋白在PubMed數據庫檢索該蛋白對應的基因。在GEPIA數據庫中輸入基因，查找該基因的簡要描述，再次確定該基因是調節(jié)抗氧化應激關鍵基因。

將檢索的這些靶點對應的人基因在GEPIA數據庫中進行分析這些潛在靶點基因和表達抗氧化應激關鍵蛋白(超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶、轉錄因子Nrf- 2)的基因的相關性分析。

在基因相關性分析功能中，以二氫丹參酮Ⅰ作用胃癌潛在靶點基因為橫坐標，抗氧化應激關鍵基因為縱坐標，分別輸入待檢測基因相關性的兩個基因。相關系數選擇Pearson，選擇TCGA Tumor數據庫中的STAD Tumor。然后點擊得出其相關性關系的結果。采用Pearson方法確定相關系數。相關強度為使用以下絕對值指南確定：0.00～0.19“非常弱”，0.20～0.39“弱”，0.40～0.59“中等”0.60～0.79“強”，0.80～1.0“非常強”，P值<0.05，被認為具有統(tǒng)計學意義。

1.2.2 二氫丹參酮Ⅰ作用胃癌潛在靶點基因在胃癌患者的表達水平分析

通過Pearson相關性和統(tǒng)計顯著性評估二氫丹參酮Ⅰ作用胃癌潛在靶點在胃癌患者的基因表達分析。 在GEPIA數據Express DIY中選擇Boxplot(當然也可以選擇Profile或者Stage plot等)，在基因框內輸入潛在靶點基因，|Log2 FC|Cutoff選擇“1”，P值選擇“0.01”，選擇紅色為潛在靶點基因在腫瘤中表達，藍色為潛在靶點基因在正常組織中表達。數據庫設置選擇“STAD”， Log Scale選擇“Yes”， Jitter Size選擇“0.4”，選擇匹配TCGA和GTEx數據庫，最后點擊，得出分析結果。

1.2.3 二氫丹參酮Ⅰ作用胃癌潛在靶點基因在胃癌患者的預后分析

用Prognoscan和Kaplanmeier圖生成生存曲線。在GEPIA數據庫Surnival中選“Surnival Plot”，在基因框內輸入二氫丹參酮Ⅰ作用胃癌潛在靶點基因，方法選擇“Overall Survival”，選擇最佳Cutoff-High(%)，Hazards Ratio(HR)選擇“Yes”， 95% Confidence Interval選擇“Yes”， Axis Units選擇“Months”。 二氫丹參酮Ⅰ作用胃癌潛在靶點基因在胃癌患者高表達選擇紅色，低表達選擇藍色。數據庫設置選擇“STAD”，最后得出生存曲線圖。運用同樣的方法得出無瘤生存曲線圖。

2 結 果

2.1 在數據庫檢索二氫丹參酮作用胃癌AGS細胞靶點研究的文獻

從PubMed、CNKI等數據庫檢索二氫丹參酮Ⅰ作用腫瘤靶點基因的文獻，一共76篇。經過閱讀題目、摘要以及全文后篩選符合檢索條件的文獻。結果如下。見表1。

表1二氫丹參酮Ⅰ作用腫瘤靶點基因的文獻表

從表1可以得知，關于二氫丹參酮Ⅰ作用胃癌靶點，報道二氫丹參酮與胃癌相關研究的文獻有2篇。在這些腫瘤的文獻中，二氫丹參酮作用于腫瘤的主要作用的靶向基因(蛋白)為缺氧誘導因子-1(hif-1)和瓜氨酸組蛋白H3(CITH3)，分別對應的基因是HIF1A和NOS2。

2.2 二氫丹參酮Ⅰ的作用靶點與抗氧化應激關鍵基因的關系

表達抗氧化應激關鍵蛋白酶(超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶、轉錄因子Nrf- 2)的基因分別是：SOD1、CAT、GPX1、NFE2L2。

在GEPIA數據庫中分別檢索HIF1 A和NOS2基因和表達抗氧化應激關鍵基因SOD1、CAT、GPX1、NFE2L2之間相關關系。

2.2.1 HIF1A和SOD1、CAT、GPX1、NFE2L2相關關系

GEPIA數據庫顯示HIF1A和SOD1相關性P=0.28，R=0.054，由于P=0.28，大于0.05，差異無統(tǒng)計學意義，即是HIF1A和SOD1無明顯相關性，見圖1A；HIF1A和CAT相關性P<0.001，R=0.18，由于P<0.001，小于0.05，差異有統(tǒng)計學意義，即是HIF1A和CAT有正相關關系，見圖1B；HIF1A和GPX1相關性P=0.033，R=0.11，由于P=0.033，小于0.05，差異有統(tǒng)計學意義，即是HIF1A和GPX1有正相關關系，見圖1C；HIF1A和NFE2L2相關性P<0.001，R=0.41，由于P<0.001，小于0.05，差異有統(tǒng)計學意義，即是HIF1A和NFE2L2有正相關關系，見圖1D。

2.2.2 NOS2和SOD1、CAT、GPX1、NFE2L2相關關系

GEPIA數據庫顯示NOS2和SOD1相關性P<0.001，R=0.18，差異有統(tǒng)計學意義，即是NOS2和SOD1具有正相關性，見圖2A；NOS2和CAT相關性P=0.99，R=- 0.67，由于P>0.05，差異無統(tǒng)計學意義，即是NOS2和CAT無相關關系，見圖2B；NOS2和GPX1相關性P=0.17，R=- 0.068，由于P>0.05，差異無統(tǒng)計學意義，即是NOS2和GPX1無正相關關系，見圖2C；NOS2和NFE2L2相關性P=0.37，R=- 0.045，差異無統(tǒng)計學意義，即是NOS2和NFE2L2無相關關系，見圖2D。

圖1 HIF1A和SOD1、CAT、GPX1、NFE2L1的相關關系

圖2 NOS2和SOD1、CAT、GPX1、NFE2L2相關關系

2.3 二氫丹參酮Ⅰ的作用潛在靶點在胃癌患者的表達水平

HIF1A和NOS2在胃癌患者高表達(白色)。

圖3 HIF1A和NOS2在胃癌患者中的表達

這個是HIF1A和NOS2在胃癌的表達水平，HIF1A和NOS2在胃癌中表達顯著增高(白色)，灰色表示HIF1A和NOS2在胃癌癌旁組織中低表達。見圖3。

2.4 二氫丹參酮Ⅰ潛在靶點對胃癌患者預后的影響

HIF1 A和NOS2在胃癌患者預后的影響。HIF1A高表達，胃癌患者的總體生存率(Overall Survival)下降，相反，HIF1A低表達，胃癌患者的總體生存率(overall survival)提升，P=0.017，P<0.05，HR(high)=0.5；HIF1A低表達，胃癌患者的無瘤生存率(Disease Free Survival)視乎高于HIF1A高表達的胃癌患者，但是由于P=0.057，P>0.05，差異無統(tǒng)計學意義，見圖4A、B。同理，NOS2高表達或者低表達，其在胃癌患者的總體生存率和無瘤生存率都是無統(tǒng)計學差異，P值分別為0.21、0.18(見圖4C和D)。

3 討 論

氧化代謝已經是機體細胞物質代謝和能量代謝重要途徑之一。氧化應激伴隨著自由基的產生。在機體細胞中產生活性氧(ROS)，包括超氧化物和過氧化氫等，用于信號傳遞，作為免疫反應的效應器，以及作為細胞代謝的副產物[17]。目前相當一部分的網絡數據庫被用作科學研究是有價值的。Gene Expression Profiling Interactive Analysis數據庫(簡稱GEPIA數據庫)(http://gepia.cancer-pku.cn/index.html)，包括癌癥基因組圖譜(TCGA數據庫)和基因型組織表達(GTEx數據庫)產生數以萬計份癌癥和非癌癥樣本RNA測序數據，為包括癌癥生物學在內的許多相關研究領域提供了前所未有的機遇。到目前為止，除了726個癌旁組織數據之外，TCGA數據庫已經產生33種癌癥類型9 736個腫瘤樣本數據。

圖4 HIF1和NOS2在胃癌患者預后的影響

細胞凋亡被學者們定義為是程序性細胞死亡(PCD)的過程。細胞凋亡是一種基因調控現(xiàn)象。在高倍顯微鏡和電鏡下發(fā)現(xiàn)它引起細胞形態(tài)學方面的改變、出血、核碎裂、細胞收縮、染色質凝聚、染色體DNA碎裂和整體mRNA衰變[18- 20]。

缺氧誘導因子-1(hif-1)，它的基因名為HIF1A。缺氧誘導因子(HIF-1)是一種二聚體轉錄復合物，是細胞對低氧(缺氧)反應適應過程中的一個重要調節(jié)因子，主要因其在維持氧和能量均一性中的作用而被認識[21]。由于細胞增殖率高，腫瘤細胞生長速度快，以及新血管生成機制，腫瘤中常發(fā)生缺氧供血不足，缺氧是腫瘤環(huán)境中常見的一種情況[22]。低氧微環(huán)境有利于腫瘤的生長和轉移，對腫瘤的發(fā)生和發(fā)展起作用。本項目以及本部分文獻綜述表明，二氫丹參酮Ⅰ作用胃癌細胞，產生活性氧介導氧化應激，抑制HIF-1的表達，而文獻報道低氧環(huán)境促進HIF-1的高表達出現(xiàn)腫瘤進展和轉移[23- 26]。因此，我們認為，二氫丹參酮作用胃癌細胞，產生活性氧介導氧化應激，抑制HIF-1的表達，從而抑制胃癌細胞的生長和轉移，促進胃癌細胞凋亡。

抗氧化應激系統(tǒng)主要包括超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)[27]以及轉錄因子Nrf- 2[28- 29]。

超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD，基因名SOD1)自1968年發(fā)現(xiàn)SOD以來，已被證明具有重要的生物學意義，超氧化物歧化酶(SODS)是保護細胞免受活性氧(ROS)侵害的必要的抗氧化酶。超氧化物歧化酶在體內可以直接清除氧化反應產生過多的自由基，保護細胞膜免受活性氧的過氧化作用導致細胞膜脂質發(fā)生過氧化，從而維護細胞膜的生理功能。在本部分GEPIA數據庫研究里，HIF1A和SOD1相關關系圖，P=0.28，R=0.054，HIF1A和SOD1無相關性。即是說，丹參酮干預后胃癌后可導致HIF1A低表達，可能不是通過潛在降低SOD1的活性減少胃癌的抗氧化應激，誘導細胞凋亡，可能存在其他潛在靶點機制。

過氧化氫酶(Catalase，CAT，基因名cat) 包含四個相同的62 kda亞單位，每個亞單位包含四個不同的結構域和一個假體血紅素基團。過氧化氫酶的主要生理作用是抗氧化物，催化過氧化氫轉化為水和氧這一系列生化反應，屬于抗氧化劑。在酶促反應導致H2O2共價鍵斷裂的過程中，過氧化氫酶首先被氧化成一種高價鐵中間物的化合物I(CPD I)，然后被第二個H2O2分子還原回靜止狀態(tài)。過氧化氫酶不直接清除氧自由基，主要清除體內細胞氧化反應產生的過氧化氫，緩解或者避免細胞膜脂質過氧化作用，從而維持細胞膜正常的生理功能，使得機體細胞達到氧化還原反應的動態(tài)平衡狀態(tài)，機體內環(huán)境穩(wěn)態(tài)得以保持。由于過氧化氫酶該酶雖不直接清除自由基,但可降低自由基，因此其可能介導了胃癌的抗氧化應激效果。HIF1A與它表達呈正相關。根據文獻報道，丹參酮干預后胃癌后可導致HIF1A低表達，因此，也潛在地減少了CAT的表達水平，減少了胃癌的氧化應激耐受，促進了胃癌的氧化應激凋亡。

谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidases，GPxs，基因名GPX1)其生物化學和生理功能發(fā)揮是以還原型谷胱甘肽為底物清除氧化反應生成過多的過氧化物，例如減少自由基生成、清除過多的自由基、過氧化氫以及羥自由基等。還原型谷胱甘肽是機體內細胞主要的活性形式存在。其抗氧化應激系統(tǒng)主要表現(xiàn)在兩方面的調控：一是調控谷胱甘肽過氧化物酶的含量，二是調控谷胱甘肽還原酶的含量。較早以前研究發(fā)現(xiàn)[30]，細胞谷胱甘肽(GSH)早期下降，隨后活性氧(ROS)生成增加，在沒有任何外部凋亡刺激的情況下，誘導多種凋亡信號(在不同時間點例如24 h、48 h、72 h均可檢測到)，當線粒體谷胱甘肽耗盡時，ROS產生增加內發(fā)生不可逆的凋亡，這表明降低谷胱甘肽過氧化物酶的含量可以潛在地誘導細胞凋亡。二氫丹參酮Ⅰ作用胃癌細胞，以活性氧為介導的氧化應激反應抑制HIF1A，致HIF1A低表達，且HIF1A與GPX1表達呈正相關。因此，也潛在地減少了谷胱甘肽過氧化物酶的表達水平，減少了胃癌的抗氧化應激作用，促進了胃癌的氧化應激凋亡，即促進了誘導胃癌細胞凋亡。

轉錄因子Nrf- 2，它的基因名是NFE2L2。1996年Venugopal R第一次提出轉錄因子Nrf- 2的抗氧化作用[31]。轉錄因子Nrf- 2的抗氧化機制大概如下[32]：轉錄因子Nrf- 2在胞漿內與Keap1(Kelch樣ech相關蛋白1)結合成二聯(lián)體，此二聯(lián)體在活性氧親電子劑的作用下解離成轉錄因子Nrf- 2和Keap1(Kelch樣ech相關蛋白1)，然后轉錄因子Nrf- 2轉入細胞核，在核內與Maf(亮氨酸的一種拉鏈蛋白)結合，作用在核酸5′-TGACnnnGCA- 3′，啟動相關抗氧化應激基因表達，相關抗氧化應激酶高活性或者高表達，從而清除活性氧等氧自由基等，達到抗氧化應激目的。從本研究結果來看，二氫丹參酮Ⅰ作用胃癌細胞，以活性氧為介導的氧化應激反應抑制HIF1A，致HIF1A低表達，根據GEPIA數據庫結果得知，HIF1A與轉錄因子Nrf- 2表達呈正相關，即是低表達的HIF1A也可能潛在地抑制轉錄因子Nrf- 2對胃癌的抗氧化應激作用，促進了胃癌的氧化應激凋亡。

HIF1A的表達結果表明它在胃癌中表達增高(白色)，而在胃癌癌旁組織中HIF1A呈現(xiàn)低表達(灰色)。預后分析HIF1A高表達，胃癌患者的總生存率降低，P=0.017，表明HIFA1確實在胃癌中高表達，而高表達后胃癌患者的總體生存率(Overall Survival)下降。因此，對胃癌中采用二氫丹參酮Ⅰ干預的潛在機制：二氫丹參酮Ⅰ干預可能下降HIFA的表達水平，具有潛在性通過調控了CAT、GPX1、NFE2L2的表達水平；二氫丹參酮Ⅰ干預可能下降NOS2的表達水平，具有潛在性通過調控了SOD1的表達水平；從而減少胃癌細胞的抗氧化應激潛力，促進腫瘤氧化應激凋亡，且HIFA的高表達顯著影響了胃癌患者的預后。因此，采用二氫丹參酮Ⅰ可能有望改善患者的預后，在胃癌的進一步應用中具有良好的臨床前景。