張寧萍 方穎 劉雪靜 謝黎 吳健 沈錫中

非酒精性脂肪性肝炎(NASH)發(fā)病率日益升高，但其發(fā)病機(jī)制尚未明確。NASH的肝細(xì)胞以線粒體異常為特征，線粒體損傷是促進(jìn)單純性脂肪肝向NASH進(jìn)展的重要因素之一[1- 2]。正常生理?xiàng)l件下，受損線粒體可以通過(guò)自噬機(jī)制(即線粒體自噬)被及時(shí)清除[3]。肝細(xì)胞自噬缺陷與脂肪滴堆積、胰島素抵抗、NLRP3炎癥小體活化有關(guān)[4]。N-乙酰半胱氨酸(NAC)是還原型谷胱甘肽的前體，有保護(hù)肝細(xì)胞作用，用于藥物性肝損傷的治療[5]。研究者的前期研究提示，NAC能改善游離脂肪酸誘導(dǎo)的大鼠原代肝細(xì)胞線粒體自噬功能缺陷[6]，但其體內(nèi)作用尚不明確。本研究通過(guò)建立高脂高糖誘導(dǎo)的NASH小鼠模型，以NAC進(jìn)行干預(yù)，觀察NAC對(duì)NASH小鼠肝細(xì)胞線粒體自噬的影響。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)C57BL/J6小鼠18只，6～8周齡，雄性，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。飼養(yǎng)于復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

二、主要試劑與儀器

主要儀器：熒光分光光度計(jì)(Nanodrop)，PCR儀(BIO-RAD)，電泳儀(BIO-RAD)，全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)(Tanon)，Real-Time定量PCR儀(Thermo)，快速型血糖儀(羅氏公司)，單電子激光共聚焦顯微鏡(Leica)，倒置顯微鏡(Nikon)，熒光顯微鏡(Nikon)。主要試劑：甘油三酯檢測(cè)試劑盒(南京建成生物研究所)，Masson染色試劑盒(武漢谷歌生物科技有限公司)，抗體：β-actin(Santa Cruz)，COX IV(Abcam)，LC3B(Novus)，Parkin(Proteintech)，PINK1(Santa Cruz)，P62(Proteintech)。

三、動(dòng)物分組與模型建立

小鼠分別于耳緣打孔編號(hào)，在適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為3組：正常飲食對(duì)照組，高脂高糖誘導(dǎo)NASH組(HFCD)，高脂高糖喂養(yǎng)同時(shí)添加NAC干預(yù)實(shí)驗(yàn)組(HFCD+NAC)，每組6只。高脂高糖誘導(dǎo)NASH給藥方法參見(jiàn)本課題組研究論文[7]，HFCD+NAC組在高脂高糖喂養(yǎng)同時(shí)按照每日150 mg/kg經(jīng)飲用水給予NAC干預(yù)。NAC配制方法：1L飲用水(高糖水)中加入0.45 g NAC，調(diào)整pH值為7.0。分別于喂養(yǎng)16周后對(duì)3組小鼠實(shí)施安樂(lè)死，并保留肝臟和外周血液標(biāo)本。

四、測(cè)定指標(biāo)及方法

(一)肝臟指數(shù)及組織病理學(xué)檢查 新鮮肝組織完整分離后稱重，計(jì)算肝臟指數(shù)=肝臟濕重/體重×100%。福爾馬林固定肝組織后石蠟包埋切片，HE染色及Masson染色后光鏡下觀察肝臟變化。

(二)血清生化指標(biāo)檢測(cè) 小鼠眼眶取血，3 000 rpm離心10 min后分離血清，由全自動(dòng)生化儀檢測(cè)血清ALT、AST、IL-1β?？崭寡峭ㄟ^(guò)取小鼠尾靜脈血由羅氏快速血糖儀檢測(cè)。

(三)肝組織甘油三酯定量檢測(cè) 采用南京建成生物研究所甘油三酯(TG)檢測(cè)試劑盒(A110-2)檢測(cè)。過(guò)程按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

(四)組織免疫熒光染色 肝組織冰凍切片用預(yù)冷丙酮固定10 min，PBS 洗滌3次。3% BSA室溫封閉30 min。擦干封閉液后加一抗(COX IV標(biāo)記線粒體，LC3B標(biāo)記自噬)，平放于濕盒內(nèi)4℃過(guò)夜。第二天PBS 洗滌3次。加二抗后避光室溫孵育1小時(shí)。PBS 洗滌3次。加DAPI染液，避光室溫孵育10 min。PBS 洗滌3次。蓋玻片封片后在單電子激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

(五)RT-PCR檢測(cè) 提取肝臟總RNA后經(jīng)熒光分光光度計(jì)檢測(cè)RNA定量。取2 μg總RNA為模板，配置20 μL反應(yīng)體系，按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。RT-PCR每個(gè)目的基因或內(nèi)參均配制3管。反應(yīng)體系為：SYBR green MIX 10 μL，目的基因/內(nèi)參正引物 1.0 μL，目的基因/內(nèi)參正引物 1.0 μL，cDNA 2.0 μL，ddH2O 6.0 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃ ×10 min，循環(huán)45次，95℃ ×15秒，60℃ ×1 min，繪制熔解曲線。結(jié)果用目的基因與內(nèi)參基因的相對(duì)表達(dá)量表示，計(jì)算方法采用ΔΔCT法。

(六)Western blot檢測(cè) 肝組織勻漿后，12 000 g離心5 min，收集上清得到總蛋白溶液。經(jīng)15%-8%濃度的SDS-PAGE凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移到PVDF膜。將PVDF膜放入5%的脫脂牛奶-TBST封閉1 小時(shí)。分別4 ℃孵育Parkin、PINK1、LC3B、P62、β-actin一抗過(guò)夜。TBST洗滌后，二抗室溫孵育30 min，TBST 洗滌3次。將ECL發(fā)光液加在PVDF膜的蛋白面上反應(yīng)1-2 min，吸除多余發(fā)光液后放入全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)拍照。

五、統(tǒng)計(jì)分析

近似正態(tài)分布的計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，計(jì)數(shù)資料采用n(%)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述。多組間計(jì)量資料的比較采用ANOVA進(jìn)行檢驗(yàn)，組間多重比較采用LSD法進(jìn)行檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確卡方檢驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)分析應(yīng)用SPSS 18.0或Graphpad 6.0軟件，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、 NAC對(duì)NASH小鼠肝臟的影響

對(duì)照組小鼠肝臟外形正常，呈鮮紅色，質(zhì)地柔軟。HFCD組(圖1B)肝臟逐漸增大，呈黃白色，表面可見(jiàn)顆粒樣改變。HFCD+NAC組(圖1C)肝臟大體組織形態(tài)變化較HFCD組(圖1A)輕。HE染色對(duì)照組肝細(xì)胞形態(tài)正常，肝小葉內(nèi)結(jié)構(gòu)完整，肝索排列整齊有序，肝細(xì)胞未見(jiàn)變性、壞死或炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。HFCD組肝細(xì)胞逐漸出現(xiàn)小泡型及大泡小泡混合型的脂肪沉積及部分壞死，且范圍由散在加重至廣泛。匯管區(qū)周?chē)装Y細(xì)胞浸潤(rùn)，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)以大量單個(gè)核細(xì)胞為主，細(xì)胞核被脂滴擠壓到細(xì)胞邊緣(圖1E)。HFCD+NAC組肝細(xì)胞炎癥及脂肪沉積情況較HFCD組輕(圖1F)。Masson染色，HFCD組及HFCD+NAC組肝組織纖維化較對(duì)照組顯著，但相對(duì)于HFCD組，HFCD+NAC組肝組織纖維化無(wú)明顯減輕(圖1G-I)。

圖1 對(duì)照組、HFCD、HFCD+NAC組小鼠肝臟大體

與對(duì)照組相比，HFCD組及HFCD+NAC組小鼠體質(zhì)量及肝重增加，空腹血糖、肝臟甘油三酯及血清ALT、AST、白細(xì)胞介素1-β(IL-1β)升高，其中HFCD+NAC組較HFCD組肝臟甘油三酯及血清ALT、AST、IL-1β降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

二、 NAC對(duì)NASH小鼠肝細(xì)胞線粒體自噬的影響

小鼠肝組織冰凍切片以COX IV和LC3B雙重染色分別標(biāo)記線粒體和自噬小體，在共聚焦纖維鏡下觀察比較3組小鼠肝組織內(nèi)線粒體自噬的水平可見(jiàn)：對(duì)照組小鼠肝組織中的線粒體(COX IV)呈點(diǎn)狀均勻分布，HFCD組肝組織內(nèi)COX IV表達(dá)量下降，且為團(tuán)塊狀聚集，提示線粒體損傷逐漸加重。同時(shí)，HFCD組LC3B表達(dá)也明顯降低。相對(duì)于HFCD組，HFCD+NAC組COX IV和LC3B表達(dá)量升高，提示線粒體自噬較HFCD組活躍。見(jiàn)圖2A。

RT-PCR法檢測(cè)小鼠肝臟線粒體自噬相關(guān)基因Atg5、Atg7、Parkin/PARK2、PINK1表達(dá)量，HFCD組及HFCD+NAC組均較對(duì)照組下降，但相對(duì)于HFCD組，HFCD+NAC組的線粒體自噬相關(guān)基因在mRNA水平上升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖2D。

蛋白印跡法檢測(cè)各組小鼠肝組織內(nèi)Parkin、PINK1的蛋白表達(dá)及自噬水平變化。結(jié)果顯示，HFCD組小鼠較對(duì)照組肝組織內(nèi)Parkin、PINK1表達(dá)降低，同時(shí)LC3B II/I比值降低，P62表達(dá)量增高。提示HFCD組小鼠肝細(xì)胞線粒體自噬水平降低。HFCD+NAC組較HFCD組線粒體自噬水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖2B-C。

討 論

還原型谷胱甘肽是存在于肝臟中的抗氧化分子，能通過(guò)抗自由基作用抑制線粒體通透性改變、調(diào)控凋亡。NAC是谷胱甘肽的前體，具有抗氧化劑作用和血管舒張作用，可以減輕組織缺氧，在臨床中常用于藥物性肝損傷、急性肝衰竭等肝病的治療[5, 8-9]。

表1 對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組小鼠一般情況、血生化指標(biāo)比較(±s)

A.小鼠肝組織冰凍切片免疫熒光雙染色。B.小鼠肝細(xì)胞線粒體自噬相關(guān)蛋白Western blot顯影結(jié)果。C.Western blot相對(duì)灰度比。D.小鼠肝細(xì)胞線粒體自噬相關(guān)基因Atg5、Atg7、Parkin/PARK2、PINK1的mRNA相對(duì)表達(dá)量。

圖2NAC對(duì)NASH小鼠肝細(xì)胞線粒體自噬的影響

線粒體異常是NASH患者肝細(xì)胞病變的特征之一[10-13]。線粒體對(duì)氧化應(yīng)激損傷十分敏感。NASH進(jìn)程中高游離脂肪酸造成的脂毒性導(dǎo)致肝細(xì)胞損害，刺激生成過(guò)量ROS，無(wú)法清除時(shí)蓄積的ROS會(huì)攻擊線粒體造成線粒體腫脹，線粒體內(nèi)呼吸鏈復(fù)合體酶活性下降，引起線粒體途徑的內(nèi)源性ROS(mtROS)生成增多及ATP合成減少，導(dǎo)致線粒體損傷和功能障礙。外源性ROS和mtROS還可以直接造成線粒體DNA(mtDNA)斷裂和損傷[13-14]。通常受損傷的線粒體通過(guò)線粒體自噬途徑被清除，并減少線粒體途徑的內(nèi)源性ROS生成，保護(hù)線粒體功能穩(wěn)定，確保應(yīng)激的細(xì)胞存活[3, 15]。線粒體自噬下降，細(xì)胞防衛(wèi)功能缺失，過(guò)量的mtROS累積攻擊線粒體造成線粒體膜破裂，使線粒體向胞質(zhì)內(nèi)釋放細(xì)胞色素C凋亡誘導(dǎo)因子等凋亡相關(guān)蛋白，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以及導(dǎo)致細(xì)胞死亡[4]。

我們前期研究證實(shí)，NASH小鼠肝細(xì)胞線粒體自噬水平下降誘導(dǎo)NLRP3炎癥小體活化，是導(dǎo)致NASH肝細(xì)胞炎癥進(jìn)展的因素之一。同時(shí)，體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)提示，NAC可以通過(guò)抑制細(xì)胞ROS和mtROS形成，部分恢復(fù)線粒體自噬水平，從而抑制NLRP3炎癥小體活化[6]。本研究通過(guò)NASH模型小鼠進(jìn)一步證實(shí)，添加NAC減輕了高脂高糖誘導(dǎo)的NASH小鼠肝臟細(xì)胞脂肪沉積和炎癥。相對(duì)于HFCD組，HCFD+NAC組小鼠肝細(xì)胞受損的線粒體自噬水平升高，且部分線粒體功能恢復(fù)。提示NAC可能通過(guò)改善肝細(xì)胞線粒體自噬，進(jìn)而減輕肝細(xì)胞炎癥進(jìn)展。