陳永燦 張建志 司同

（中國科學(xué)院深圳先進技術(shù)研究院，深圳合成生物學(xué)創(chuàng)新研究院，深圳 518055）

釀酒酵母被用于制作面包和釀酒已有數(shù)千年的歷史，是與人類關(guān)系最密切的微生物之一。由于其具有遺傳背景清晰、生長迅速、抗逆性高、無噬菌體污染等優(yōu)勢，在生物制藥、食品、化工和能源等領(lǐng)域均有廣泛應(yīng)用［1-2］。同時，釀酒酵母還是現(xiàn)代分子和細胞生物學(xué)研究的真核模式生物。

基因編輯和轉(zhuǎn)錄調(diào)控工具在釀酒酵母的基礎(chǔ)研究和工業(yè)應(yīng)用中起著十分重要的作用。細菌和古細菌中存在CRISPR/Cas9（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9）系統(tǒng)，可以特異性地降解外源遺傳物質(zhì)，進行適應(yīng)性免疫防御。近年來，該系統(tǒng)被廣泛開發(fā)應(yīng)用于包括釀酒酵母在內(nèi)不同物種的基因編輯［3-6］。CRISPR/Cas9 系統(tǒng)由核酸內(nèi)切酶Cas9（CRISPRassociated protein 9）、CRISPR RNA（crRNA）和反式激活RNA（trans-activating crRNA，tracrRNA）組成。其中，crRNA 與tracrRNA 形成二級結(jié)構(gòu)并招募Cas9蛋白；crRNA 和tracrRNA 也可以融合為向?qū)NA（guide RNA，gRNA）以簡化操作。Cas9 蛋白與核酸結(jié)合的復(fù)合體可以特異性結(jié)合到PAM（Photospacer adjacent motif，NGG）位點相鄰并與crRNA 互補的DNA 序列。接著，Cas9 內(nèi)切酶的HNH 結(jié)構(gòu)域切割與crRNA 互補的DNA 鏈，RuvC 結(jié)構(gòu)域切割另一條DNA 鏈，形成DNA 雙鏈斷裂（double-strand break，DSB），斷裂位點位于PAM 位點上游三個核苷酸的位置［7］。同源重組（Homologous recombination，HR）是釀酒酵母中主要的DNA 修復(fù)方式。同源片段存在時，通過CRISPR/Cas9 特異性引入DNA 雙鏈斷裂，可對釀酒酵母基因組進行精準的敲除、敲入和突變［8-9］。

除基因編輯外，CRISPR 系統(tǒng)在轉(zhuǎn)錄調(diào)控、表觀遺傳編輯、堿基編輯和細胞成像等方面也有廣泛應(yīng)用［10-12］。這些應(yīng)用主要基于核酸內(nèi)切酶活性缺陷的dCas9（Nuclease-deficient Cas9）蛋白，而這一突變體通過在Cas9 的RuvC 和HNH 結(jié)構(gòu)域分別引入D10A 和H840A 突變獲得［13］。釀酒酵母中，將dCas9 靶向基因的啟動子區(qū)域，即有一定的轉(zhuǎn)錄抑制作用；但通過融合或募集不同類型的轉(zhuǎn)錄調(diào)控結(jié)構(gòu)域，如轉(zhuǎn)錄抑制因子、激活因子或表觀遺傳修飾酶等［13-17］，并結(jié)合精巧的gRNA 設(shè)計［18-19］，可以進一步實現(xiàn)多模式（Multi-mode）、多位點（Multiplex）、正交性（Orthogonal）的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控。

本文針對釀酒酵母中基于CRISPR/dCas9 的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控工具的開發(fā)和應(yīng)用進行綜述。介紹了通過與不同轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域的結(jié)合來調(diào)節(jié)dCas9 或gRNA的活性，概括了dCas9 和gRNA 表達的設(shè)計與優(yōu)化方法；討論了影響CRISPR/dCas9 體系轉(zhuǎn)錄調(diào)控效率、特異性和通量的靶向性因素；總結(jié)了該工具在釀酒酵母代謝工程中的應(yīng)用；最后，對該工具的未來研究方向提出了展望。

1 釀酒酵母中CRISPR/dCas9 工具的開發(fā)

1.1 針對基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控模式的設(shè)計與優(yōu)化

轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子通常由DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)錄調(diào)控結(jié)構(gòu)域組成。研究人員將dCas9 或gRNA 進行改造，使CRISPR/dCas9 系統(tǒng)與轉(zhuǎn)錄抑制因子、激活因子或表觀遺傳修飾酶等相結(jié)合，從而將這些轉(zhuǎn)錄調(diào)控結(jié)構(gòu)域靶向目的基因的特定位置，實現(xiàn)不同模式的基因調(diào)控［20］（圖1）。

1.1.1 dCas9 融合轉(zhuǎn)錄調(diào)控結(jié)構(gòu)域 由于空間位阻效應(yīng)，當gRNA 引導(dǎo)dCas9 靶向目的基因的特定位置時，能起到轉(zhuǎn)錄抑制作用，被稱為CRISPR 抑制（CRISPR interference，CRISPRi）［13，21］。在細菌中單純使用dCas9 進行基因表達抑制的效率可高達99.9%［13］，而在釀酒酵母中，單純利用dCas9 通常僅能起到50%-60%的抑制效果［18，21-22］，這樣的抑制水平與其它真核生物中的報道一致［23-24］。這些實驗結(jié)果表明，單獨使用dCas9 無法在真核細胞中高效抑制轉(zhuǎn)錄起始或阻擋RNA 聚合酶的前進。另一方面，當dCas9 與轉(zhuǎn)錄抑制結(jié)構(gòu)域融合時，可顯著提高其在真核體系中的轉(zhuǎn)錄抑制能力［25］（圖1-A）。Gilbert 等［23］將dCas9 與哺乳動物來源的Mxi1 蛋白的轉(zhuǎn)錄抑制結(jié)構(gòu)域［26］相融合，發(fā)現(xiàn)對報告基因的表達抑制效果從單純使用dCas9 時的18 倍提高至53 倍。在解脂耶氏酵母中，dCas9-Mxi1 相比dCas9 把Ku80基因的轉(zhuǎn)錄抑制效率從38%提高至87%［27］。為了進一步優(yōu)化CRISPRi 在釀酒酵母中的效率，Lian 等篩選了多個內(nèi)源轉(zhuǎn)錄抑制因子［28-32］，發(fā)現(xiàn)在與dCas9 結(jié)合時，釀酒酵母TUP1、MIG1、XTC1、UME6 等蛋白的結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄抑制水平高于哺乳細胞Mxi1。他們同時發(fā)現(xiàn)將多個內(nèi)源抑制結(jié)構(gòu)域同時與dCas9 融合時，可以進一步提高轉(zhuǎn)錄抑制效率。例如，當靶向釀酒酵母的組成型PTEF1啟動子時，dCas9-Mix1、dCas9-TUP1 和dCas9-TUP1-MIG1-UME6對于 熒光報告基因表達的抑制效率分別為65%、74%和82%［19］。綜合以上結(jié)果表明，與轉(zhuǎn)錄抑制結(jié)構(gòu)域的融合能夠顯著提升dCas9 在釀酒酵母中的轉(zhuǎn)錄抑制效率，并且可以利用內(nèi)源轉(zhuǎn)錄因子、融合多重結(jié)構(gòu)域等方式進一步提升抑制效率。

dCas9 與轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域融合可實現(xiàn)對靶基因表達的上調(diào)，被稱為CRISPR 激活（CRISPR activation，CRISPRa）［33］。常用的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域有VP16、VP64、p65AD 和Rta 等［34-36］（ 圖1-A）。Farzadfard 等［21］在釀酒酵母中將dCas9 與VP64 融合并靶向最小化PCYC1啟動子，使報告基因的熒光強度提高了3 倍左右。在dCas9-VP64 的基礎(chǔ)上融合多個轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域，可以進一步增強基因上調(diào)效率［36-38］。如Chavez 等利用融合了3 個轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域的dCas9-VPR（VP64-p65AD-Rta），使HED1和GAL7的表達分別提高了38 倍和78 倍，而dCas9-VP64僅使二者分別提高 了9倍和14 倍［36］。此外，對于不同的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域，融合不同來源的CRISPR 蛋白也會導(dǎo)致激活效率的差異。Lian 等測試了4 種不同來源的內(nèi)切酶活性缺失Cas 蛋白（dSpCas9，dSaCas9，dSt1Cas9，dLbCpf1） 與3 種轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（VP64（V），VP64-p65AD（VP），VP64-p65AD-Rta（VPR））的所有組合，發(fā)現(xiàn)不同的dCas 蛋白最優(yōu)的激活結(jié)構(gòu)域組合是不同的：對于dSpCas9，激活效率最好的是VPR；對于dSt1Cas9，激活效率最好的是V；對于dLbCpf1，激活效率最好的是VP；而對于dSaCas9，不同組合激活效果均比較微弱［19］。以上結(jié)果表明，dCas9 與轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域的融合蛋白可有效上調(diào)靶基因轉(zhuǎn)錄水平，但不同dCas 蛋白和激活結(jié)構(gòu)域的組合需要分別進行優(yōu)化。

1.1.2 gRNA 融合適配子 除了將轉(zhuǎn)錄調(diào)控結(jié)構(gòu)域與dCas9 蛋白融合外，還可以改造gRNA 結(jié)構(gòu)使其同時具有目的基因靶向序列和效應(yīng)蛋白招募序列，從而利用RNA-蛋白質(zhì)相互作用招募轉(zhuǎn)錄調(diào)控結(jié)構(gòu)域［25］。Zalatan 等和Kiani 等將RNA 適配子（RNA aptamer）與gRNA 的3'末端的tracrRNA 融合，另外將轉(zhuǎn)錄抑制或激活結(jié)構(gòu)域與RNA 適配子結(jié)合蛋白融合，通過RNA 適配子與其結(jié)合蛋白的相互作用招募轉(zhuǎn)錄調(diào)控結(jié)構(gòu)域，實現(xiàn)了靶基因的特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控（圖1-B）［39-40］。利用Scaffold RNA（scRNA）策略與融合VP64 的RNA 結(jié)合蛋白，Zalatan 等在釀酒酵母中將一個合成型報告啟動子激活了50 倍，而dCas9-VP64 的策略僅實現(xiàn)了2-3 倍的激活［39］。與dCas9 融合多個轉(zhuǎn)錄抑制或激活結(jié)構(gòu)域策略類似，作者將多個適配子融合在同一個scRNA 中，從而可招募多個RNA 結(jié)合蛋白以增強其轉(zhuǎn)錄調(diào)控的能力［39］。另外，通過系統(tǒng)性測試，Zalatan 等［39］發(fā)現(xiàn)了特異性的3 個RNA 適配子—結(jié)合蛋白的配對（MS2：MCP、PP7：PCP 和com：COM，圖1-B），為多個結(jié)合蛋白與不同調(diào)控結(jié)構(gòu)域融合構(gòu)建正交性的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子奠定基礎(chǔ)。綜上，scRNA 技術(shù)提供了一種與dCas9 融合蛋白技術(shù)相互補的策略，可以對多基因靶標進行多模式調(diào)控，在基因互作研究、代謝通路組合式優(yōu)化等方面有重要的應(yīng)用價值。

1.2 針對dCas9或gRNA表達的設(shè)計與優(yōu)化

優(yōu)化dCas9 蛋白的定位、表達水平和誘導(dǎo)表達等性質(zhì)，可以提高CRISPR/dCas9 系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控效率。dCas9 需要定位到細胞核中以發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控的功能，通常情況下，會在dCas9 的氨基端或羧基端融合一段SV40 核定位序列（Nuclear localization sequence，NLS）［21，41-42］，也可在兩端同時融合一段NLS 序列［43］或在羧基端融合兩段NLS 序列［23］。優(yōu)化dCas9 蛋白表達量的手段包括調(diào)節(jié)密碼子偏好、啟動子強度和表達載體拷貝數(shù)等。由于不同物種同義密碼子偏好性不同，密碼子優(yōu)化是提高重組蛋白異源表達效率的可能途徑［44］；釀酒酵母中，基于化膿性鏈球菌野生型、人或釀酒酵母密碼子偏好性優(yōu)化的dCas9 序列均有所應(yīng)用［21，23，38，42，45］。通常情況下，轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的表達量越高，對靶基因的抑制或激活的效率也越高［46］。因此，大部分研究使用了比較強的組成型啟動子或糖酵解途徑啟動子來驅(qū)動dCas9 的表達。例如，PTEF1、PTDH3、PGPD1和PPDC1等［23，36，42］（表1），但是也有研究表明強啟動子驅(qū)動的dCas9 的表達會降低釀酒酵母的適應(yīng)度和生長速度［47］。對于dCas9 基因的表達載體，既可將dCas9 表達框整合到釀酒酵母的基因組中［21］，也可將其克隆到自主復(fù)制質(zhì)粒上［23，38，42，45］（表1）。除了dCas9 的組成型表達外，還可以使用誘導(dǎo)型啟動子使其在化學(xué)小分子或光誘導(dǎo)條件下表達。例如，通過利用半乳糖和無水四環(huán)素誘導(dǎo)合成型啟動子驅(qū)動dCas9-VP64 的基因轉(zhuǎn)錄，F(xiàn)arzadfard 等在釀酒酵母中將最小化PCYC1啟動子驅(qū)動的熒光報告基因的轉(zhuǎn)錄水平提高了70 倍［21，48］。在蛋白穩(wěn)定性方面，Khakhar 等［45］通過融合降解子序列，實現(xiàn)了植物生長素誘導(dǎo)的SCF（Skp1-Cullin-F-box）泛素連接酶復(fù)合物依賴的dCas9 蛋白降解。這些條件性表達或穩(wěn)定性調(diào)控的策略進一步提高了CRISPR/dCas9 系統(tǒng)在轉(zhuǎn)錄調(diào)控中應(yīng)用的可控性［49-51］。

圖1 通過融合或招募轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域調(diào)整dCas9 或gRNA 的活性

調(diào)節(jié)gRNA 的轉(zhuǎn)錄水平也是優(yōu)化CRISPR/dCas9轉(zhuǎn)錄調(diào)控性能的重要方法。首先，利用不同類型的天然啟動子可以用來調(diào)節(jié)gRNA 的轉(zhuǎn)錄水平。與RNA 聚合酶相對應(yīng)，真核生物啟動子可分為I 型（rRNA）、II 型（mRNA） 和III 型（snoRNA、tRNA等）。由于II 型啟動子會在gRNA 的5'和3'端添加額外的核苷酸從而干擾其正常功能，因此一般利用III 型啟動子驅(qū)動gRNA 的表達，如PSNR52和PRPR1等［6，21，23］（表1）。然而，由于III 型啟動子的轉(zhuǎn)錄本長度較短，為了提高gRNA 設(shè)計和表達的靈活性，Gao 等［52］通過在gRNA 兩端分別融合錘頭型核酶（Hammerhead-type ribozymes）和HDV 核酶（Hepatitis delta virus）在釀酒酵母細胞中實現(xiàn)了由II 型PADH1啟動子驅(qū)動的gRNA 的表達（表1）。這種含有核酸酶的gRNA 稱為RGR（Ribozyme-flanked gRNA）?；谠撛O(shè)計，Deaner 等［18］利用II 型的PTEF1啟動子將gRNA 的轉(zhuǎn)錄水平比III 型的PSNR52啟動子提高了3.88 倍，顯著提高了dCas9-VPR 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制效率（gRNA 靶點的位置效應(yīng)，見下文）。而Gander等［53］利用最小化PCYC1啟動子驅(qū)動RGR 的轉(zhuǎn)錄，基于dCas9-Mxi1 建立的非邏輯門顯示了最小的泄漏并具有數(shù)字響應(yīng)，為更加復(fù)雜的遺傳電路研究奠定了基礎(chǔ)。除組成型啟動子外，還可以改造天然的III型啟動子使其具有對環(huán)境因素變化響應(yīng)的能力，從而增強dCas9 調(diào)控工具的可控性。例如，研究人員通過在III型PRPR1啟動子中整合Tet操縱子結(jié)合位點，實現(xiàn)無水四環(huán)素對gRNA 的誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄，以及2-20 倍的轉(zhuǎn)錄調(diào)控動態(tài)范圍［21，38，42，54］。這些不同啟動子驅(qū)動的多種設(shè)計方案為gRNA 的表達量、通量和對gRNA 表達的控制提供了有力的工具和多樣的選擇。

1.3 針對靶向性能的設(shè)計與優(yōu)化

除了dCas9 和gRNA 元件的表達外，靶向性能也是決定CRISPR/dCas9 基因調(diào)控能力的重要因素。具體而言，dCas9/gRNA 復(fù)合體能否容易且準確地接近單個或多個目的區(qū)域的特定位點，決定了轉(zhuǎn)錄調(diào)控的有效性、準確性和多重性。以下將從gRNA 的序列特征、靶點位置與可接近性、靶基因數(shù)量等3個方面總結(jié)了影響CRISPR/dCas9 工具靶向性能的關(guān)鍵因素。

表1 釀酒酵母中dCas9 和gRNA 的表達

1.3.1 gRNA 的長度、 序列特異性和二級結(jié)構(gòu) gRNA中的向?qū)蛄校℅uide sequence） 與DNA 靶序列互補配對，其長度和序列特異性對于CRISPR/dCas9 系統(tǒng)的靶向特異性有重要影響（圖2-A）。在大腸桿菌的CRISPRi 研究中，Qi 等［13］對向?qū)蛄械拈L度進行了截短或延長，發(fā)現(xiàn)20 nt 的原始長度是轉(zhuǎn)錄抑制效率最高的，并且隨著該區(qū)域長度的截短導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄抑制效率快速下降，最短的有效長度是12 nt；在哺乳動物細胞中，Kiani 等［40］發(fā)現(xiàn)使用10-20 nt 的向?qū)蛄芯苁筪Cas9-VPR 有效地發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活的功能。但是，在向?qū)蛄虚L度小于18 nt 時Cas9 介導(dǎo)的基因編輯功能基本缺失，表明轉(zhuǎn)錄調(diào)控相比基因編輯對向?qū)蛄械拈L度變化有更大的耐受性。對于向?qū)蛄械奶禺愋?，Qi 等［13］對向?qū)蛄袉吸c突變的篩選結(jié)果表明，PAM 及距其最近的7 個堿基對轉(zhuǎn)錄抑制至關(guān)重要。Smith 等［42］在釀酒酵母中的研究結(jié)果與此一致，無論是全長還是截短型向?qū)蛄?，距PAM 最近的10 nt 對dCas9-Mxi1 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制效率影響較大。因此，雖然PAM 遠端的核苷酸為向?qū)蛄性O(shè)計提供了一定的靈活性，但截短或錯配均會降低CRISPR/dCas9 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控的效率。另外，Smith 等［55］利用dCas9-Mxi1 對靶向1 631 個基因的超過18 000 個gRNA 的篩選實驗發(fā)現(xiàn)，gRNA 的靶向效率還與其二級結(jié)構(gòu)相關(guān)（斯皮爾曼相關(guān)性系數(shù)為-0.11），即gRNA 中向?qū)蛄?、骨架序列和PRPR1啟動子前導(dǎo)序列（Leader sequence）之間的堿基配對會降低gRNA 的靶向效率，因此在設(shè)計gRNA 時應(yīng)盡量避免。

1.3.2 gRNA 靶向的DNA 單鏈和位點 gRNA 靶點也會對CRISPR/dCas9 的轉(zhuǎn)錄調(diào)控效率產(chǎn)生影響，這些因素包括不同的DNA 鏈、基因結(jié)構(gòu)域、靶點與TATA 框（TATA box）或轉(zhuǎn)錄起始位點（Transcription start site，TSS）的距離等。在釀酒酵母中，F(xiàn)arzadfard 等［21］將dCas9-VP64 靶向不同DNA 鏈的相近位置，發(fā)現(xiàn)二者具有相似的轉(zhuǎn)錄調(diào)控水平。高通量的gRNA 文庫篩選研究也表明，gRNA 的效率并沒有DNA 鏈的偏好性［33，42］。在作用機制方面，dCas9-gRNA 復(fù)合體不僅是作為轉(zhuǎn)錄過程的路障，更是共同建立了促進轉(zhuǎn)錄起始或終止的新環(huán)境［56］。

與DNA 鏈特異性效應(yīng)不同，gRNA 靶點的位置效應(yīng)非常明顯（圖2-B）。對于dCas9-VP64 或VPR等介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活，通常將gRNA 靶向TATA 框和TSS 的上游；而對于dCas9 融合蛋白介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制，通常將gRNA 靶向TATA 框附近或其下游［21，37］。在釀酒酵母中當gRNA 靶向TSS 上游約50-400 bp 區(qū)域時dCas9-VPR 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活效率較高，與哺乳動物細胞中dCas9-SunTag：scFV-VP64 的實驗結(jié)果一致［33，37］。當dCas9-VPR 靶向TATA 框上游50 bp之內(nèi)時，可能由于抑制了RNA 聚合酶與靶基因的結(jié)合，轉(zhuǎn)錄激活的效率急劇下降［37］。值得注意的是，當dCas9-VPR 靶向開放閱讀框（Open reading frame，ORF）區(qū)域時，反而起到了轉(zhuǎn)錄抑制的作用［18］。另一方面，Smith 等利用dCas9-Mxi1 測試了靶向20個釀酒酵母基因的約1 000 個gRNA。結(jié)果顯示，gRNA 靶點位于TSS 上游200 bp 范圍時轉(zhuǎn)錄抑制效率較高［42］，進一步對超過1 500 個基因的篩選將該區(qū)域縮小到TSS 上游125 bp 范圍［55］。與之相比，Gilbert 等［33］發(fā)現(xiàn)哺乳動物細胞中dCas9-KRAB 依賴的最大轉(zhuǎn)錄抑制效率的靶點區(qū)域為TSS -50 到+300 bp。利用gRNA 靶點位置效應(yīng)的特性，Deaner 和Alper 綜合利用dCas9-VPR 和dCas9-Mxi1 對目標基因表達進行不同程度的下調(diào)和上調(diào)，從而實現(xiàn)了基因轉(zhuǎn)錄的梯度調(diào)控（Graded modulation）［37］。例如，針對PGPD1啟動子，調(diào)控后報告熒光蛋白yECitrine的表達水平是對照組的0.2、0.6、0.7、3、4 和8.5倍，動態(tài)范圍超過40 倍。然而，Jensen 等［38］在TSS 上游200 bp 范圍內(nèi)設(shè)計了靶向12 個釀酒酵母啟動子的88 個gRNA，其中一些gRNA 對dCas-VPR或Mxi1 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活或抑制是無效的。因此，在選擇CRISPR/dCas9 系統(tǒng)的靶點時，除了宿主細胞的不同，還需在合適區(qū)域內(nèi)設(shè)計多個gRNA 進行具體的測試。

1.3.3 gRNA 靶點的可接近性 除了gRNA 序列的本體特征和gRNA 靶點所處的基因結(jié)構(gòu)域外，gRNA 靶點的可接近性也是CRISPR/dCas9 系統(tǒng)有效發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用的重要因素，如染色質(zhì)高級結(jié)構(gòu)和核小體占據(jù)等（圖2-C）。釀酒酵母等真核生物中染色質(zhì)以DNA 纏繞組蛋白形成的核小體形式存在并具有復(fù)雜和動態(tài)的高級結(jié)構(gòu)［57-58］。之前研究表明，靶向同一個啟動子臨近位置的不同gRNA 具有不同的轉(zhuǎn)錄調(diào)控效率［21，38，42］。利用釀酒酵母高分辨率的核小體占據(jù)譜數(shù)據(jù)［59-60］，Smith 等發(fā)現(xiàn)在TSS 上下游400 bp 范圍內(nèi)gRNA 的轉(zhuǎn)錄抑制效率與染色質(zhì)可接近性呈正相關(guān)［42］。體外實驗表明，核小體的占據(jù)抑制了Cas9 蛋白與PAM 的相互作用，當在體系中加入染色質(zhì)重塑蛋白SNF2h 或RSC 復(fù)合物后，該抑制作用被削弱［61-62］。特別的是，在人類細胞系中CRISPR/dCas9 依賴的轉(zhuǎn)錄抑制研究表明，有效的gRNA 定位還與開放的染色質(zhì)環(huán)境和轉(zhuǎn)錄活躍相關(guān)的組蛋白修飾如H3K9ac、H3K27ac、H3K4me2、H3K4me3、H3K79me2 等有關(guān)［63-64］。綜上，基于CRISPR/dCas9轉(zhuǎn)錄調(diào)控的效率受到靶點附近染色質(zhì)微環(huán)境的影響，設(shè)計gRNA 時應(yīng)參考核小體占據(jù)和DNA 可接近性的高分辨率圖譜［59-60，65-66］，避免靶向核小體DNA 的核心區(qū)域。

1.3.4 gRNA 的數(shù)量 與dCas9 融合多個轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白結(jié)構(gòu)域或gRNA 融合多個適配子的思路類似，靶向同一目的基因的多條gRNA 能夠協(xié)同調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄（圖3-A）。Farzadfard 等［21］組合使用兩條gRNA 時將轉(zhuǎn)錄抑制的效率從2 倍提高到了7 倍，Deaner 等［18］同樣利用兩條gRNA 提高了dCas9-VPR介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制水平。此外，還可以通過在啟動子內(nèi)人工合成相同的靶序列，實現(xiàn)多條單一gRNA介導(dǎo)的協(xié)同調(diào)控。Farzadfard 等［21］利用含有12 個gRNA 結(jié)合位點的合成型啟動子，將dCas9-VP64 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活提高了70 倍，Gilbert 等［23］利用含有7 個Tet 操縱子結(jié)合位點的合成型啟動子，將dCas9介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制提高了115 倍。

圖2 影響CRISPR-dCas9 系統(tǒng)靶向的因素

利用靶向多個目的基因的多條gRNA 或scRNA可實現(xiàn)多重性（Multiplex）的轉(zhuǎn)錄調(diào)控（圖3-B）。Jensen 等［38］利 用dCas9 與scRNA 將Mxi1 和VPR等轉(zhuǎn)錄調(diào)控結(jié)構(gòu)域靶向類胡蘿卜素和三酰甘油生物合成途徑的多個基因，顯著增加了相關(guān)產(chǎn)物的產(chǎn)量。Ferreira 等［54］利用來自綠膿假單胞菌的核糖核酸內(nèi)切酶Csy4，實現(xiàn)了PRPR1啟動子驅(qū)動單條轉(zhuǎn)錄本中3 個gRNA 的轉(zhuǎn)錄和釋放，實現(xiàn)了同時對OLE1，HGM1和ACS1等多個基因進行轉(zhuǎn)錄調(diào)控。此外，基于CRISRP/dCas9 工具中組成元件相互作用的特異性，可以設(shè)計彼此正交的gRNA，在同一細胞中對多個目標基因?qū)崿F(xiàn)不同模式的基因調(diào)控。例如，利用不同RNA 適配子與其結(jié)合蛋白的特異性識別，Zalatan 等［39］設(shè)計彼此正交、與不同轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子結(jié)合的scRNA 序列（圖3-B），在同一菌株中對紫色桿菌素合成通路的不同分支的基因進行轉(zhuǎn)錄抑制和轉(zhuǎn)錄激活，通過調(diào)控代謝流實現(xiàn)了不同產(chǎn)物的定向合成。利用不同Cas 蛋白識別不同PAM 序列的特點，Lian 等［19］測試了不同來源的dCas 蛋白和多種轉(zhuǎn)錄激活或抑制結(jié)構(gòu)域的組合，構(gòu)建了基于dLbCpf1-VP、dSpCas9-RD1152 和SaCas9 的釀酒酵母三相基因調(diào)控策略，稱為CRISPR-AID（Transcriptional Activation，transcriptional Interference，and gene Deletion）。作者設(shè)計了彼此正交、與不同Cas 蛋白對應(yīng)的gRNA 序列（圖3-C），在同一細胞中可以實現(xiàn)對多個目的基因進行轉(zhuǎn)錄抑制、轉(zhuǎn)錄激活、基因敲除等不同模式的調(diào)控。綜上，多重gRNA 的設(shè)計與使用能夠提高單個靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控能力，實現(xiàn)多個靶基因的單向多重調(diào)控，還能夠利用正交性設(shè)計系統(tǒng)實現(xiàn)靶基因的多重和多模式調(diào)控。通過增加可同時操作的基因靶點和調(diào)控模式，有助于從多個工程化改造靶點中快速找到最優(yōu)的調(diào)控策略及其組合，即利用組合式優(yōu)化為復(fù)雜基因線路、合成途徑和細胞代謝的設(shè)計和改造提供有力工具。

2 釀酒酵母中CRISPR/dCas9 工具在代謝工程中的應(yīng)用

圖3 利用多條gRNA 進行協(xié)同、多重或多模式轉(zhuǎn)錄調(diào)控

在釀酒酵母細胞工廠的優(yōu)化過程中，平衡內(nèi)源或外源代謝通路的基因表達水平是提高目的產(chǎn)物產(chǎn)量的重要手段。CRISPR/dCas9 轉(zhuǎn)錄調(diào)控工具可對多重基因的表達進行精細和多模式調(diào)控，從而通過代謝工程的理性設(shè)計和代謝靶點的高通量篩選等手段優(yōu)化釀酒酵母的物質(zhì)和能量流動，提高目的產(chǎn)物的產(chǎn)量和效率等。

首先，利用CRISPR/dCas9 轉(zhuǎn)錄調(diào)控工具的多重基因靶向和多模式調(diào)控的優(yōu)點，可對釀酒酵母代謝通路多種關(guān)鍵酶的基因表達進行理性設(shè)計。例如，上調(diào)或下調(diào)甲羥戊酸（Mevalonate，MVA）途徑的關(guān)鍵基因HMG1、ERG9和ERG20等，能夠提高類異戊二烯的產(chǎn)量［67-68］。Jensen 等［38］利用dCas9 和scRNA 將轉(zhuǎn)錄調(diào)控結(jié)構(gòu)域Mxi1 或VPR 靶向HMG1、HMG2、ERG9、ERG20、PGK1或TDH3等基因的啟動子區(qū)域，通過測試多種轉(zhuǎn)錄調(diào)控的組合提高了類胡蘿卜素的產(chǎn)量。而Lian 等［19］利用CIRSPR-AID方法對釀酒酵母中甲羥戊酸途徑限速酶基因HMG1的表達進行了上調(diào)，對處于β-胡蘿卜素和甾醇生物合成分支點的必需基因ERG9的表達進行了下調(diào)，同時敲除了轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子ROX1基因，使得β-胡蘿卜素的產(chǎn)量提高了2.8 倍。另外，Jensen 等［38］將dCas9-VPR 同時靶向OLE1和DGA1基因的啟動子區(qū)域，使得三酰基甘油的產(chǎn)量提高了2 倍以上。

其次，揭示基因型與表型的關(guān)系仍是代謝工程的一大挑戰(zhàn)，由于具有易于設(shè)計使用和高通量的優(yōu)點，CRISPR/dCas9 可用于代謝通路靶基因表達強度與表型關(guān)系的的高通量篩選和研究。例如，Deaner和Alper 利用dCas9-VPR 或dCas9-Mxi1 以及靶向啟動子不同位置的gRNA 文庫建立了一種梯度式的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控工具，實現(xiàn)不同水平的基因表達上調(diào)和下調(diào)。他們將該方法用于系統(tǒng)性測試代謝通路中不同催化步驟對于調(diào)控干擾的敏感性（Systematically Test Enzyme Perturbation Sensitivities，STEPS）， 構(gòu)建了甘油、3-脫氫莽草酸發(fā)酵和木糖分解的代謝通量敏感性圖譜（Flux sensitivity map）［37］。通過對通量敏感性圖譜進行迭代分析，依次鑒定了甘油發(fā)酵中GPD1、TPI1等基因編碼的酶是合成通路中的限速步驟，并通過工程化改造菌株使甘油的產(chǎn)量從4.89g/L 提高至28g/L。通過類似的方法，又將3-脫氫莽草酸的產(chǎn)量提高至126.4mg/L。Ferreira 等［69］利用dCas9-VPR 和靶向168 個基因的3194 個gRNA 組成的文庫，結(jié)合基于轉(zhuǎn)錄因子FapR 的丙二酰輔酶A生物傳感器，利用流平衡分析篩選了促進代謝流向丙二酰輔酶A 的靶基因和gRNA。利用篩選的結(jié)果，使3-羥基丙酸的產(chǎn)量得到顯著提高。

如上所述，由于具有多重靶基因多模式轉(zhuǎn)錄調(diào)控和易于高通量等優(yōu)勢，基于CRISPR/dCas9 的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控工具在代謝靶點篩選、機制研究和代謝通路的工程化改造等方面具有廣泛的應(yīng)用，是基因編輯工具的重要補充。隨著該工具的進一步開發(fā)和優(yōu)化，基于CRISPR/dCas9 的轉(zhuǎn)錄調(diào)控工具定能在微生物細胞工廠及其它領(lǐng)域有更加廣泛的應(yīng)用。

3 結(jié)論與展望

綜上所述，CRISPR/dCas9 系統(tǒng)在釀酒酵母中提供了一種高效率和可編程的靶向基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控策略。該策略包括如下優(yōu)點：（1）gRNA 易于設(shè)計和使用；（2）可實現(xiàn)多重靶基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控；（3）可通過改變gRNA 靶點的具體位置等實現(xiàn)梯度式基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控；（4）可通過組合正交性的scRNA 或dCas 系統(tǒng)同時實現(xiàn)基因轉(zhuǎn)錄的激活和抑制。但是，目前釀酒酵母中CRISPR/dCas9 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控的效率普遍仍比大腸桿菌或哺乳動物細胞偏低［13，23，36］，相關(guān)調(diào)控工具還需要進一步開發(fā)和優(yōu)化。

就dCas 元件而言，可以擴展dCas 蛋白的類型、物種來源以及轉(zhuǎn)錄調(diào)控結(jié)構(gòu)域類型等。除了廣泛使用的SpCas9 外，Lian 等［19］測試了其它物種來源的Cas9 蛋白，如NmCas9、St1Cas9、SaCas9，以及兩種物種來源的Cpf1，即AsCpf1、LbCpf1，并系統(tǒng)的比較了它們在基因編輯、轉(zhuǎn)錄抑制或激活方面的性能。這不僅擴大了PAM 位點的選擇范圍，還為轉(zhuǎn)錄調(diào)控的優(yōu)化提供了借鑒。此外，除了常用的Mxi1、KRAB 和VPR 外，Lian 等測試并發(fā)現(xiàn)來源于UME6、MIG1 和TUP1 的結(jié)構(gòu)域組合具有更強的轉(zhuǎn)錄抑制作用。Keung 等［70］基于可編程的鋅指蛋白測試了213種釀酒酵母染色質(zhì)調(diào)節(jié)因子，并對它們的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用模式進行了系統(tǒng)分析，為多樣化轉(zhuǎn)錄調(diào)控結(jié)構(gòu)域提供了參考。而且，DNA 甲基化、組蛋白修飾等表觀遺傳學(xué)機制同樣在基因轉(zhuǎn)錄等生物學(xué)過程中起著多樣化而且重要的作用［71］。利用dCas9 與表觀遺傳修飾酶全長或活性結(jié)構(gòu)域的融合進行靶向表觀遺傳修飾的編輯，可對基因表達進行調(diào)控以實現(xiàn)特定的生物學(xué)效應(yīng)，在深化理解哺乳動物細胞的生物學(xué)過程、開發(fā)基因治療或細胞治療的工具中有廣泛應(yīng)用［72-74］。釀酒酵母作為單細胞真核生物，有豐富的組蛋白修飾和組蛋白修飾酶，并廣泛參與到DNA 轉(zhuǎn)錄調(diào)控中［75］。然而，雖然在哺乳動物中通過表觀遺傳編輯進行轉(zhuǎn)錄調(diào)控已有很多應(yīng)用案例，但在釀酒酵母中的研究仍十分匱乏，這也為釀酒酵母轉(zhuǎn)錄調(diào)控的表觀遺傳編輯工具開發(fā)和應(yīng)用指明了一個重要方向。

就gRNA元件而言，雖 然CHOPCHOP［76］等計算機輔助設(shè)計工具被應(yīng)用于轉(zhuǎn)錄調(diào)控gRNA 的設(shè)計當中，但相關(guān)算法以基因編輯為核心，對CRISPR/dCas9 介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄調(diào)控效率的影響因素并未有充分考慮。針對這一局限，Smith 等［42］開發(fā)了用于酵母CRISPRi 的gRNA 設(shè)計工具（http：//lp2.github.io/yeast-crispri/），算法原理涉及基因組位置、染色質(zhì)可接近性、核小體占據(jù)、gRNA 長度與序列和轉(zhuǎn)錄因子占據(jù)等。未來的設(shè)計算法開發(fā)還應(yīng)綜合考慮各類轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域及結(jié)合方式、不同dCas 蛋白及PAM 序列、靶點染色質(zhì)微環(huán)境、菌株背景等因素，且需要依據(jù)全基因組范圍大規(guī)模篩選等實驗結(jié)果進行優(yōu)化。目前，dCas9 轉(zhuǎn)錄激活在釀酒酵母中尚無gRNA 輔助設(shè)計工具。另外值得注意的是，通常CRISPR/dCas9 系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄激活效率與靶基因的基礎(chǔ)表達呈負相關(guān)，即靶基因基礎(chǔ)表達水平越高，對其轉(zhuǎn)錄增強的效率越低［36，38］。因此，還需針對每個靶基因設(shè)計特異性的、更為有效的轉(zhuǎn)錄調(diào)控方法。