時(shí)倩倩 高彥 王李理 孫廣莉 陳秀英 李曉鵬 崔龍江

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy,DR)是常見的致盲性眼科疾病，嚴(yán)重危害患者的身心健康，影響患者的生存質(zhì)量。有研究顯示，約40%的糖尿病患者視網(wǎng)膜有明顯的血管病變，且一旦血糖無法控制會(huì)導(dǎo)致視網(wǎng)膜持續(xù)出血，嚴(yán)重影響視力[1]。持續(xù)的高血糖狀態(tài)會(huì)致使血-視網(wǎng)膜屏障受損，視網(wǎng)膜微血管異常增生，纖維組織增加，視網(wǎng)膜功能受到影響，患者視力下降[2]。臨床DR治療以羥苯磺酸鈣等西藥為主[3]，盡管療效肯定，但其毒副作用及后期效果不明顯等缺點(diǎn)不容忽視，應(yīng)用中醫(yī)藥經(jīng)典方劑進(jìn)行DR防治研究具有重要的臨床價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義。

杞菊地黃湯源自清朝《醫(yī)級(jí)寶鑒》，主治肝腎虧虛導(dǎo)致的視物不清，現(xiàn)在臨床主要用于治療白內(nèi)障、老年性黃斑變性、青光眼以及DR等多種眼部慢性疾病[4-5]。此外，杞菊地黃湯具有良好的降血壓和降血糖功效[6-7]，相比于西藥單一作用途徑和靶點(diǎn)，該方在治療DR上有其獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。目前，杞菊地黃湯及其成藥研究主要集中在臨床，涉及分子機(jī)制的基礎(chǔ)研究不多，而其是否能夠抑制視網(wǎng)膜血管生成尚未見報(bào)道。本研究從DR發(fā)生發(fā)展相關(guān)的視網(wǎng)膜新生血管著手，旨在探明杞菊地黃湯的作用途徑及內(nèi)在機(jī)制，為其臨床推廣應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物杞菊地黃湯由枸杞、菊花、熟地黃、山茱萸、山藥、牡丹皮、茯苓、澤瀉等藥物組成，原藥材均購買于北京同仁堂有限公司，全方水提2次，合并提取液，濃縮至所需體積。羥苯磺酸鈣膠囊購自寧夏康亞藥業(yè)公司，規(guī)格為每粒0.25 g，直接蒸餾水溶解使用。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)雄性Sprague Dawley大鼠60只，體質(zhì)量200～220 g，8周齡，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司(合格證號(hào)為201801532971)。動(dòng)物購入后先適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，而后開始正式實(shí)驗(yàn)。

1.3 主要試劑與儀器STZ(美國(guó)Sigma)；血糖儀、血糖試紙(美國(guó)Johnson)；血管生成素-1(Ang-1)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)試劑盒(南京建成)；缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2(VEGFR2)一抗(美國(guó)Cell Signaling Technology)；HRP-IgG二抗(武漢博士德)；熒光素鈉注射液(廣州白云山)；視網(wǎng)膜成像系統(tǒng)(加拿大Optoprobe)；光學(xué)顯微鏡(德國(guó)Zeiss)。

1.4 造模、分組與給藥方法取50只Sprague Dawley大鼠，禁食12 h后一次性給予STZ溶液(尾靜脈注射)40 mg·kg-1，72 h后檢測(cè)大鼠空腹血糖(FBG)，以FBG≥16.7 mmol·L-1視為糖尿病模型建立成功(動(dòng)物均造模成功)。挑選48只糖尿病模型大鼠按照血糖隨機(jī)分為4組：模型組、羥苯磺酸鈣組、杞菊地黃湯高劑量組、杞菊地黃湯低劑量組，每組12只，10只未處理大鼠為對(duì)照組。分組完成后，除對(duì)照組外，其他組大鼠均給予高脂飼料喂養(yǎng)4周，隨機(jī)挑選4只大鼠進(jìn)行眼底熒光素血管造影(FFA)檢查，觀察視網(wǎng)膜是否具有病變。而后開始給藥，羥苯磺酸鈣組給予等效劑量的羥苯磺酸鈣溶液(5.4 mg·kg-1)，杞菊地黃湯高、低劑量組分別給予臨床等效2倍、1倍劑量的復(fù)方中藥(16.74 g·kg-1、8.37 g·kg-1)，每天給藥1次，持續(xù)4周。給藥完成后，檢測(cè)所有大鼠FBG，每組各選取5只大鼠行FFA檢查，麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血，分別取左右眼視網(wǎng)膜保存于液氮中備用。

1.5 FFA檢查觀察視網(wǎng)膜血管生成情況FFA檢查前采用復(fù)方托吡卡胺滴眼液使大鼠充分散瞳，予以腹腔注射100 g·L-1熒光素鈉溶液(1 mL·kg-1)，注射完成后觀察各組大鼠右眼視網(wǎng)膜微血管數(shù)量及熒光素有無滲漏。

1.6 ELISA檢測(cè)大鼠血清中Ang-1、VEGF含量收集各組大鼠血清后，采用ELISA試劑盒檢測(cè)血清中Ang-1、VEGF的含量，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和吸光度(A)值計(jì)算各組大鼠血清中Ang-1和VEGF含量。

1.7 Western-blot觀察各組大鼠視網(wǎng)膜HIF-1α、VEGFR2蛋白表達(dá)取各組大鼠視網(wǎng)膜組織，加入1 mL RIPA組織裂解液，充分勻漿、離心，測(cè)定總蛋白含量。Western-blot檢測(cè)主要步驟：制備分離膠和濃縮膠，蛋白上樣，80 V恒壓電泳至溴酚藍(lán)跑出分離膠后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，50 g·L-1脫脂奶粉室溫下封閉1 h，分別加入稀釋后的兔抗大鼠多克隆一抗(11000)，4 ℃孵育過夜。第2天用TBST液洗3次，每次15 min，加入山羊抗兔單克隆二抗(1500)室溫下孵育4 h，TBST液洗3次，每次15 min，化學(xué)發(fā)光法顯影。應(yīng)用Image J軟件分析條帶灰度值，根據(jù)目的蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值的比值計(jì)算HIF-1α、VEGFR2的相對(duì)表達(dá)量。

1.8 RT-PCR檢測(cè)大鼠視網(wǎng)膜Ang-1、VEGF mRNA表達(dá)充分提取視網(wǎng)膜組織的總RNA，核酸定量?jī)x檢測(cè)核酸含量。采用PrimeScriptTMRT試劑盒與SYBR?Premix Ex Taq試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參。引物由上海吉瑪公司合成，Ang-1引物序列(206 bp):上游引物為5’-GTTAGGCCAGGAATGT-3’，下游引物為5’-CCTGGGATTCCGATTGCCA-3’；VEGF引物序列(129 bp)：上游引物為5’-GTTACGGTACCTTGAACTAC-3’，下游引物為5’-CGGCTTAATTAAGGCTTACCG-3’；GAPDH引物序列(178 bp)：上游引物為5’-GCTTACCGACTTACGGACC-3’，下游引物為5’-CCTATAGCGTTAACACTATG-3’。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，多組間比較采用ANOVA分析和LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠FBG比較對(duì)照組和模型組大鼠FBG比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；藥物干預(yù)后，高劑量杞菊地黃湯能顯著降低大鼠FBG(P<0.05)，低劑量杞菊地黃湯也具有一定的降血糖效果，而陽性藥羥苯磺酸鈣則無降血糖作用。見表1。

組別FBG/mmol·L-1Ang-1/μg·L-1VEGF/ng·L-1對(duì)照組5.41±0.086.21±0.92110.92±12.99模型組 26.41±1.21??10.71±1.34? 149.81±15.21??羥苯磺酸鈣組26.19±1.427.81±0.69#121.40±10.98##杞菊地黃湯高劑量組21.80±2.41#7.29±0.90#117.75±14.09##杞菊地黃湯低劑量組23.79±2.109.13±0.15132.00±13.21

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05、**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05、##P<0.01

2.2 各組大鼠視網(wǎng)膜血管生成情況對(duì)照組大鼠視網(wǎng)膜血管均勻分布，無熒光素滲漏；模型組大鼠能觀察到明顯的熒光素滲漏，且局部滲漏區(qū)域連接成片，眼底新生血管增多；杞菊地黃湯高劑量組和羥苯磺酸鈣組視網(wǎng)膜熒光素滲漏面積顯著減少，且基本只發(fā)生于微血管末端，微血管數(shù)量也顯著下降；杞菊地黃湯低劑量組熒光素滲漏減少，但視網(wǎng)膜上仍有較多的新生血管。見圖1。

圖1 各組大鼠右眼FFA圖

2.3 各組大鼠血清中Ang-1、VEGF含量與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清中Ang-1和VEGF含量均顯著升高(均為P<0.05)；與模型組比較，杞菊地黃湯高劑量組和羥苯磺酸鈣組血清中Ang-1、VEGF含量均顯著下降(均為P<0.05)，且杞菊地黃湯高劑量組下降更為明顯。見表1。

2.4 各組大鼠視網(wǎng)膜中HIF-1α、VEGFR2蛋白水平與對(duì)照組比較，模型組大鼠視網(wǎng)膜中HIF-1α和VEGFR2蛋白表達(dá)均顯著升高(均為P<0.01)；與模型組比較，杞菊地黃湯高劑量組和羥苯磺酸鈣組HIF-1α、VEGFR2蛋白表達(dá)均顯著下降(均為P<0.01)，杞菊地黃湯低劑量組HIF-1α蛋白表達(dá)下降(P<0.05)。見圖2、表2。

圖2 各組大鼠視網(wǎng)膜中HIF-1α、VEGFR2蛋白電泳圖 A：對(duì)照組；B：模型組； C：羥苯磺酸鈣組；D：杞菊地黃湯高劑量組； E：杞菊地黃湯低劑量組

組別HIF-1α蛋白VEGFR2蛋白對(duì)照組0.71±0.080.24±0.04模型組 0.95±0.12?? 0.51±0.06??羥苯磺酸鈣組 0.75±0.08##0.32±0.05##杞菊地黃湯高劑量組 0.76±0.07##0.29±0.03##杞菊地黃湯低劑量組0.81±0.09#0.45±0.06

注：與對(duì)照組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05、##P<0.01

2.5 各組大鼠視網(wǎng)膜中Ang-1、VEGF mRNA表達(dá)與對(duì)照組比較，模型組大鼠視網(wǎng)膜中Ang-1、VEGF mRNA表達(dá)均顯著升高(均為P<0.01)；與模型組比較，杞菊地黃湯高劑量組和低劑量組大鼠視網(wǎng)膜組織Ang-1和VEGF mRNA表達(dá)均顯著下降(均為P<0.05)。見表3。

組別Ang-1 mRNAVEGF mRNA對(duì)照組1.01±0.011.00±0.00模型組 2.71±0.45?? 1.97±0.26??羥苯磺酸鈣組 2.04±0.28##1.32±0.15##杞菊地黃湯高劑量組 1.78±0.24##1.34±0.12##杞菊地黃湯低劑量組2.25±0.24##1.62±0.20#

注：與對(duì)照組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05、##P<0.01

3 討論

DR是一種常見的糖尿病微血管并發(fā)癥，以微血管不斷形成、視網(wǎng)膜滲漏水腫、嚴(yán)重時(shí)出血等為臨床特征[8]。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)將視網(wǎng)膜病變稱為“高風(fēng)內(nèi)障”或“視瞻昏渺”，屬內(nèi)障疾病，本質(zhì)與肝腎虧虛相關(guān)。目為肝之竅，肝血營(yíng)養(yǎng)于目,目得肝血而能視，肝與腎同源，腎藏精，肝藏血，肝腎精血互用，腎虧則會(huì)影響眼的形成發(fā)育與衰退。《銀海精微·序》曰：“肝腎氣充則精彩光明，肝腎氣乏則昏矇暈眩。”杞菊地黃湯是治療肝腎精血不足的名方，方中熟地黃益腎填精補(bǔ)血，枸杞補(bǔ)益肝腎、祛風(fēng)明目，菊花清肝明目，山茱萸溫補(bǔ)肝腎，山藥補(bǔ)益固精血，牡丹皮清瀉肝火，茯苓健脾滲濕，澤瀉泄腎濕濁，全方有補(bǔ)有泄，共奏滋腎、養(yǎng)肝、明目的功效。

盡管杞菊地黃湯已在中醫(yī)臨床運(yùn)用多年，但其基礎(chǔ)研究并不廣泛。本研究發(fā)現(xiàn)，杞菊地黃湯能夠抑制視網(wǎng)膜新生血管生成，減少熒光素滲漏，保護(hù)視網(wǎng)膜組織，同時(shí)還具有良好的降血糖功效，與中藥復(fù)方多環(huán)節(jié)多途徑的作用特點(diǎn)相符。有研究表明，抑制視網(wǎng)膜新生血管的生成是DR防治的根本[9-10]。本研究所使用的陽性藥羥苯磺酸鈣即是一種血管保護(hù)劑，能夠減輕視網(wǎng)膜滲出、出血，減少微血管生成。除羥苯磺酸鈣外，臨床常使用的抗DR藥物還有胰激肽原酶和甲鈷胺，但以上藥物均無降血糖的相關(guān)報(bào)道。由此可見，杞菊地黃湯治療DR有其獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，能夠降血糖而治本，該作用與主要成分熟地黃有關(guān)。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高、低劑量的杞菊地黃湯均能有效降低DR大鼠視網(wǎng)膜中Ang-1和VEGF mRNA表達(dá)，顯示其對(duì)該靶點(diǎn)有獨(dú)特的調(diào)控作用。Ang-1和VEGF均是與血管生成密切相關(guān)的分泌因子，都參與內(nèi)皮細(xì)胞的血管形成過程[11]。其中VEGF是已知的促血管生長(zhǎng)作用最強(qiáng)的細(xì)胞因子，其表達(dá)水平與微血管形成數(shù)量呈正相關(guān)[12]。VEGF通過與其受體VEGFR2結(jié)合，誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞增生，參與新生血管形成整個(gè)過程[13]。Solà-Adell等[14]研究報(bào)道，羥苯磺酸鈣能夠作用于VEGF及其受體信號(hào)通路抑制視網(wǎng)膜微血管生成，本研究結(jié)果與該報(bào)道一致。

本研究還在明確對(duì)VEGF的重要調(diào)控作用基礎(chǔ)上，對(duì)其上下游靶點(diǎn)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)高劑量杞菊地黃湯能夠抑制視網(wǎng)膜中HIF-1α和VEGFR2蛋白的表達(dá)。研究顯示，VEGF的表達(dá)程度是受體內(nèi)血管生成刺激因子和抑制因子間相對(duì)平衡狀態(tài)的影響[15]。在缺氧狀態(tài)下，血管生成的平衡調(diào)節(jié)被打破，VEGF分泌增加，是視網(wǎng)膜發(fā)生病變的重要原因[16]。HIF-1α是一種缺氧誘導(dǎo)因子，也是VEGF的直接上游因子，在缺氧引起的細(xì)胞應(yīng)激過程中，會(huì)促使內(nèi)皮細(xì)胞分泌VEGF等血管生成促進(jìn)因子[17]。VEGF誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞生成的作用依賴于其受體完成，其中，VEGFR2與VEGF的結(jié)合能力最強(qiáng)，當(dāng)前者被敲除時(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞的增殖遷移成血管能力明顯受到抑制[18-19]。從HIF-1α被激活，到作用于VEGFR2受體進(jìn)而促使血管生成，是動(dòng)脈粥樣硬化等多種心血管疾病的重要誘因，也是促進(jìn)糖尿病創(chuàng)面愈合的關(guān)鍵信號(hào)[20]?；诖送茰y(cè)，持續(xù)的高血糖損傷血-視網(wǎng)膜屏障，致使內(nèi)皮細(xì)胞處于缺氧狀態(tài)，HIF-1α被激活，介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞分泌VEGF等促血管因子，并作用于特異性受體而參與血管新生，視網(wǎng)膜功能受到影響而發(fā)生DR。杞菊地黃湯能夠作用于VEGF的上下游靶點(diǎn)，說明其可能通過該信號(hào)發(fā)揮抑制新生血管形成的功效。

綜上所述，杞菊地黃湯能夠通過抑制HIF-1α/VEGF/VEGFR2信號(hào)通路保護(hù)視網(wǎng)膜組織，減少視網(wǎng)膜新生血管。本研究從新生血管角度闡明了杞菊地黃湯治療DR的作用機(jī)制，利于該方的推廣應(yīng)用及DR的臨床防治。