韓亞楠，程方方，武亞婷，何歡歡，宋文軍，蘇麗明，歐陽(yáng)韶，楊群慧，武 運(yùn)*

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052；2.天津商業(yè)大學(xué) 天津食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300134）

腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）是一類進(jìn)行異型發(fā)酵的革蘭氏陽(yáng)性兼性厭氧乳酸菌，是眾多傳統(tǒng)發(fā)酵制品中的優(yōu)勢(shì)菌群[1]，具有高產(chǎn)酸、抗氧化和拮抗致病菌等能力，可應(yīng)用于食品、化工、醫(yī)療等領(lǐng)域[2]。在食品行業(yè)，尤其在辣椒醬、泡菜等發(fā)酵食品中，腸膜明串珠菌通過(guò)作用于發(fā)酵初期，快速啟動(dòng)發(fā)酵，發(fā)酵糖類產(chǎn)生多種酸和醇，一方面賦予產(chǎn)品特有的風(fēng)味、質(zhì)地和口感，另一方面抑制了其他雜菌的生長(zhǎng)，提高了產(chǎn)品的安全性[3-6]。

我國(guó)發(fā)酵辣椒醬歷史悠久，傳統(tǒng)發(fā)酵辣椒醬因?yàn)槠浒l(fā)酵周期長(zhǎng)、品質(zhì)不穩(wěn)定、亞硝酸鹽易累積超標(biāo)而逐漸被人工接種發(fā)酵辣椒醬所取代[7-8]。人工接種發(fā)酵的關(guān)鍵在于直投式發(fā)酵劑的開(kāi)發(fā)，目前作為辣椒醬發(fā)酵專用直投式腸膜明串珠菌發(fā)酵劑的研究尚鮮見(jiàn)報(bào)道。MRS培養(yǎng)基作為乳酸菌的商業(yè)培養(yǎng)基已經(jīng)廣泛用于各種乳酸菌培養(yǎng)，但是不同乳酸菌菌株對(duì)營(yíng)養(yǎng)需求不同，MRS培養(yǎng)基并不能使一些乳酸菌生長(zhǎng)最大化[9-10]。發(fā)酵劑的生產(chǎn)和儲(chǔ)存是發(fā)酵產(chǎn)品大規(guī)模生產(chǎn)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，而優(yōu)化菌種培養(yǎng)基進(jìn)行菌種高密度培養(yǎng)是其中的主要環(huán)節(jié)[11-12]。

實(shí)驗(yàn)室前期已利用傳統(tǒng)篩菌方法從酸馬乳中分離得到一株亞硝酸鹽降解率高、發(fā)酵辣椒醬風(fēng)味好的腸膜明串珠菌C27[5]。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究腸膜明串珠菌C27高密度培養(yǎng)的培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件，以期為辣椒醬專用腸膜明串珠菌發(fā)酵劑的工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株和原料

腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）C27：由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室分離自酸馬乳。土豆、西紅柿、玉米、平菇：市售。

1.1.2 試劑

蔗糖、乙酸鈉、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、檸檬酸三銨、硫酸錳（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；蛋白胨（生化試劑）：山東玉寶生物科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

MRS肉湯培養(yǎng)基、MRS瓊脂培養(yǎng)基：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MJX-100B-Z生化培養(yǎng)箱：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；TU-1810APC分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；LDZX-50KBS高壓滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；LE2002E電子天平、FE28 PLus pH計(jì)：梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株活化

將保藏的腸膜明串珠菌C27接種于10 mL MRS肉湯培養(yǎng)基中，于37 ℃條件下培養(yǎng)24 h。然后按3%（V/V）的接種量接種于裝液量為50 mL/250 mL MRS肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，備用。

1.3.2 菌密度測(cè)定及活菌數(shù)的測(cè)定

按1%的接種量將活化后的發(fā)酵液接種于試驗(yàn)設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基中，37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，發(fā)酵菌液稀釋2倍，采用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)600 nm處測(cè)定吸光度值（OD600nm值）。采用平板計(jì)數(shù)法[13]測(cè)定發(fā)酵液的活菌數(shù)。

1.3.3 腸膜明串珠菌C27發(fā)酵培養(yǎng)基配方的優(yōu)化

以MRS肉湯培養(yǎng)基為對(duì)照（CK），考察碳源種類、氮源種類及生長(zhǎng)因子對(duì)腸膜明串珠菌C27菌體密度的影響。

碳源種類對(duì)腸膜明串珠菌C27菌體密度的影響：選擇麥芽糖、果糖、乳糖、蔗糖作為碳源代替MRS肉湯培養(yǎng)基中的葡萄糖（20 g/L），用0.10 mol/L HCl調(diào)pH值至6.20±0.20，滅菌后分別接入1%（V/V）活化后的發(fā)酵液，37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，測(cè)定菌體密度OD600nm值，確定最佳碳源。

氮源種類對(duì)腸膜明串珠菌C27菌體密度的影響：選擇酵母浸粉、牛肉膏、胰蛋白胨、蛋白胨作為氮源代替MRS肉湯培養(yǎng)基中的氮源（牛肉膏、酵母膏、蛋白胨）（20 g/L），用0.10 mol/L HCl調(diào)pH值至6.20±0.20，滅菌后分別接入1%（V/V）活化后的發(fā)酵液，37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，測(cè)定菌密度OD600nm值，確定最佳氮源。

不同生長(zhǎng)因子對(duì)腸膜明串珠菌C27菌體密度的影響：分別取玉米汁、土豆汁、平菇汁、西紅柿汁各10.00 g/L作為生長(zhǎng)因子代替MRS肉湯培養(yǎng)基中的吐溫-80，用0.10 mol/L HCl調(diào)pH值至6.20±0.20，滅菌后分別接入1%（V/V）活化后的發(fā)酵液，37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，測(cè)定菌密度OD600nm值，確定最佳生長(zhǎng)因子。

1.3.4 腸膜明串珠菌C27發(fā)酵培養(yǎng)基配方優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)[14-15]

選擇蔗糖添加量（A）、酵母浸粉添加量（B）、土豆汁添加量（C）為考察因素，以菌體密度OD600nm值（Y1）為響應(yīng)值，采用中心組合設(shè)計(jì)法（centralcompositedesign，CCD）設(shè)計(jì)3因素5水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，優(yōu)化培養(yǎng)基配方，因素與水平見(jiàn)表1。

1.3.5 腸膜明串珠菌C27培養(yǎng)條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)[16]

選擇培養(yǎng)溫度（X1）、培養(yǎng)基初始pH值（X2）、接種量（X3）為考察因素，菌體密度OD600nm值（Y2）為響應(yīng)值，采用中心組合設(shè)計(jì)法（CCD）設(shè)計(jì)3因素5水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，優(yōu)化腸膜明串珠培養(yǎng)條件，因素與水平見(jiàn)表2。

表2 培養(yǎng)條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 2 Factors and levels of response surface tests for culture conditions optimization

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

利用Sigmaplot10.0及Design Expert V8.06軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 腸膜明串珠菌C27發(fā)酵培養(yǎng)基配方優(yōu)化

2.1.1 最佳碳源的確定

圖1 碳源種類對(duì)腸膜明串珠菌C27菌體密度的影響Fig.1 Effect of carbon sources types on the cell density of Leuconostoc mesenteroides C27

由圖1可知，葡萄糖、麥芽糖、果糖、乳糖、蔗糖對(duì)腸膜明串珠菌C27菌體密度的影響不同，當(dāng)蔗糖為碳源時(shí)，腸膜明串珠菌C27的菌體密度最高，OD600nm值為1.038，其次為果糖（0.624），乳糖（0.213）最低。因此，選擇蔗糖為腸膜明串珠菌C27培養(yǎng)基的最優(yōu)碳源，這與任蕓香等[15]研究結(jié)果蔗糖是植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）R23的最佳碳源一致，說(shuō)明蔗糖更容易被吸收利用。

2.1.2 最佳氮源的確定

圖2 氮源種類對(duì)腸膜明串珠菌C27菌體密度的影響Fig.2 Effect of nitrogen sources types on the cell density of Leuconostoc mesenteroides C27

由圖2可知，不同氮源對(duì)腸膜明串珠菌C27菌體密度的影響不同。當(dāng)以酵母浸粉為氮源時(shí)，菌體密度最高，OD600nm值為0.719，相比于MRS肉湯培養(yǎng)基，OD600nm值是MRS肉湯培養(yǎng)基的1.51倍，其次是牛肉膏（0.355），蛋白胨（0.206）最低。分析原因可能是酵母浸粉中富含氨基酸及葉酸、尼克酸、鈷胺素，且在中性和酸性環(huán)境中對(duì)熱穩(wěn)定[17]。因此，選擇酵母浸粉為腸膜明串珠菌C27培養(yǎng)基的最優(yōu)氮源。

2.1.3 最佳生長(zhǎng)因子的確定

圖3 不同生長(zhǎng)因子對(duì)腸膜明串珠菌C27菌體密度的影響Fig.3 Effect of different growth factors on the cell density of Leuconostoc mesenteroides C27

由圖3可知，相比于MRS肉湯培養(yǎng)基，土豆汁、玉米汁對(duì)腸膜明串珠菌C27的生長(zhǎng)有明顯促進(jìn)作用，其中土豆汁促進(jìn)作用最大，而平菇汁、西紅柿汁對(duì)腸膜明串珠菌C27生長(zhǎng)促進(jìn)作用較小，因此，選擇土豆汁為腸膜明串珠菌C27培養(yǎng)基的最優(yōu)生長(zhǎng)因子。

2.1.4 腸膜明串珠菌C27發(fā)酵培養(yǎng)基配方優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)?zāi)c膜明串珠菌C27發(fā)酵培養(yǎng)基配方優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)

結(jié)果見(jiàn)表3，方差分析見(jiàn)表4。

表3 發(fā)酵培養(yǎng)基配方優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of response surface tests for fermentation medium formula optimization

表4 回歸模型的方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

采用Design Expert V8.06軟件對(duì)表3的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到以O(shè)D600nm值（Y1）為目標(biāo)函數(shù)的二次回歸方程：Y1=0.930+0.036A+0.025B+0.038C-0.041A2-0.030B2-0.023C2-0.031AB-9.500E-003AC+2.500E-003BC。由表4可知，模型極顯著（P＜0.01），失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05），說(shuō)明所選模型和試驗(yàn)有較高的擬合度，可用于腸膜明串珠菌C27高密度培養(yǎng)培養(yǎng)基配方優(yōu)化的預(yù)測(cè)?；貧w模型的校正決定系數(shù)為0.990 7，說(shuō)明有99.07%的數(shù)據(jù)的變異性可由此模型來(lái)解釋。由回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)可知，一次項(xiàng)A、B、C、交互項(xiàng)AB、AC與二次項(xiàng)A2、B2、C2對(duì)結(jié)果影響均極顯著（P＜0.01），交互項(xiàng)BC對(duì)結(jié)果影響不顯著（P＞0.05）。

響應(yīng)面圖形是響應(yīng)值對(duì)各試驗(yàn)因子所構(gòu)成的三維空間的曲面圖，反映最佳參數(shù)及各參數(shù)之間的相互作用[18-20]。采用Design Expert V8.06軟件根據(jù)回歸方程式繪制響應(yīng)面及等高線，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 蔗糖添加量、酵母浸粉添加量及土豆汁添加量交互作用對(duì)腸膜明串珠菌C27菌體密度影響的響應(yīng)曲面及等高線Fig.4 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between sucrose addition,yeast extract powder addition and potato juice addition on the cell density of Leuconostoc mesenteroides C27

由圖4可知，3個(gè)響應(yīng)面均為開(kāi)口向下的凸型曲線，說(shuō)明在選取的各因素水平范圍內(nèi)，響應(yīng)值（菌體密度OD600nm值）存在極大值。由Design Expert V8.06軟件分析得出，腸膜明串珠菌C27高密度培養(yǎng)的最優(yōu)培養(yǎng)基配方為蔗糖添加量21.13 g/L，酵母浸粉添加量21.62 g/L，土豆汁添加量13.85 g/L。在此優(yōu)化條件下，腸膜明串珠菌C27的菌體密度OD600nm值預(yù)測(cè)值為0.957。考慮實(shí)際操作的可行性，將最優(yōu)培養(yǎng)基配方修訂為蔗糖添加量21 g/L，酵母浸粉添加量22 g/L，土豆汁添加量14 g/L。為驗(yàn)證預(yù)測(cè)結(jié)果的可信度，在該最佳條件下重復(fù)試驗(yàn)3次，得腸膜明串珠菌C27菌體密度OD600nm值實(shí)際值為0.961，與預(yù)測(cè)值基本一致，說(shuō)明響應(yīng)面法優(yōu)化得到的腸膜明串珠菌C27高密度培養(yǎng)的最優(yōu)培養(yǎng)基準(zhǔn)確可靠，可用于指導(dǎo)實(shí)際生產(chǎn)。

2.2 腸膜明串珠菌C27培養(yǎng)條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)

腸膜明串珠菌C27培養(yǎng)條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5，方差分析見(jiàn)表6。

表5 培養(yǎng)條件優(yōu)化響應(yīng)面分析試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Results of response surface tests for culture conditions optimization

續(xù)表

表6 回歸模型的方差分析Table 6 Variance analysis of regression model

采用Design Expert V8.06軟件對(duì)表5的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到以O(shè)D600nm值（Y2）為目標(biāo)函數(shù)的二次回歸方程：Y2=0.95+0.099X1+0.12X2-0.04X3-0.038X12-0.18X22-0.16X32+1.750E-003X1X2-+0.025X1X3-0.057X2X3。由表6可知，模型極顯著（P＜0.01），失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05），說(shuō)明所選模型和試驗(yàn)有較高的擬合度，可用于腸膜明串珠菌C27高密度培養(yǎng)條件優(yōu)化的預(yù)測(cè)。回歸模型的校正決定系數(shù)R2Adj為0.989 6，說(shuō)明有98.96%的數(shù)據(jù)的變異性可由此模型來(lái)解釋。由回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)可知，一次項(xiàng)X1、X2、X3、交互項(xiàng)X1X3及二次項(xiàng)X12、X22、X32對(duì)結(jié)果影響極顯著（P＜0.01），交互項(xiàng)X1X3對(duì)結(jié)果影響顯著（P＜0.05），交互項(xiàng)X1X2對(duì)結(jié)果影響不顯著（P＞0.05）。

采用Design Expert V8.06軟件根據(jù)回歸方程式繪制響應(yīng)面及等高線，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 培養(yǎng)溫度、初始pH值及接種量交互作用對(duì)腸膜明串珠菌C27菌體密度影響的響應(yīng)曲面及等高線Fig.5 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between culture temperature,initial pH and inoculum on the cell density of Leuconostoc mesenteroides C27

由圖5可知，3個(gè)響應(yīng)面均為開(kāi)口向下的凸型曲線，說(shuō)明在選取的各因素水平范圍內(nèi)，響應(yīng)值（菌體密度OD600nm值）存在極大值。由Design Expert V8.06軟件分析得出，腸膜明串珠菌C27最佳高密度培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度38.38 ℃，初始pH值6.21，接種量2.37%。在此優(yōu)化條件下，腸膜明串珠菌C27的菌體密度OD600nm值預(yù)測(cè)值為1.033?？紤]實(shí)際操作的可行性，將最優(yōu)培養(yǎng)條件修訂為發(fā)酵溫度38.4 ℃，初始pH值6.2，接種量2.4%。為驗(yàn)證預(yù)測(cè)結(jié)果的可信度，在該最佳條件下重復(fù)試驗(yàn)3次，得到腸膜明串珠菌C27的菌體密度OD600nm值實(shí)際值為1.034，活菌數(shù)為1.30×109CFU/mL，說(shuō)明響應(yīng)面法優(yōu)化得到腸膜明串珠菌C27高密度培養(yǎng)條件準(zhǔn)確可靠，可用于指導(dǎo)實(shí)際生產(chǎn)。

3 結(jié)論

本研究以MRS肉湯培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，菌體密度OD600nm值為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用單因素和響應(yīng)面法優(yōu)化得到腸膜明串珠菌C27高密度培養(yǎng)的最優(yōu)培養(yǎng)基配方為：蔗糖添加量21 g/L，酵母浸粉添加量22 g/L，土豆汁添加量14 g/L；最優(yōu)培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度38.4 ℃、初始pH值6.2，接種量2.4%。在此優(yōu)化條件下培養(yǎng)24 h，腸膜明串珠菌C27的菌體密度OD600nm值達(dá)1.034，活菌數(shù)為1.30×109CFU/mL。