楊 妮，劉素純，2 *，王繼剛，李 幸，劉梟雄

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410128）

冠突散囊菌（Eurotium cristatum）又名“金花菌”，屬于散囊菌目發(fā)菌科散囊菌屬的一種灰綠色曲霉真菌[1]，廣泛存在于土壤、茯磚茶、冬蟲夏草、中藥片和木屑中。冠突散囊菌是茯磚茶發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌種[2]，可作為產(chǎn)生多種胞外酶（多酚氧化酶、果膠酶、纖維素酶、蛋白酶等）、胞外多糖和色素等的生產(chǎn)菌株[3-5]。冠突散囊菌屬具有典型顏色的閉囊殼，在馬鈴薯培養(yǎng)基上或其他培養(yǎng)基上生長時通常會代謝產(chǎn)生大量的色素物質(zhì)[6]，其主要色素為黃色素，隨著培養(yǎng)時間的延長會伴隨著黑色素的產(chǎn)生。黑色素（melanin）是一類結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣的酚類或吲哚類生物大分子色素的總稱[7]，其通常與蛋白質(zhì)、碳水化合物等絡(luò)合形成不同類型的生物大分子物質(zhì)，廣泛存在于動物、植物和微生物中[8]。黑色素一般難溶于水、酸和有機(jī)溶劑，易溶于堿溶液[9]，具有抗氧化[10-12]、抗輻射[13]、抗癌[14-15]、免疫調(diào)節(jié)[16-18]等作用，在醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、日用化工、食品及其他領(lǐng)域有很大的應(yīng)用潛力。

本試驗(yàn)擬采用響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)的方法對冠突散囊菌胞外黑色素的提取條件進(jìn)行優(yōu)化，并探討各因素之間交互作用對黑色素提取量的影響，旨在為微生物源天然功能性色素的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冠突散囊菌（Eurotium cristatum）：由湖南安化白沙溪茶廠的茯磚茶中分離獲得。氫氧化鈉、濃鹽酸（均為分析純）：由國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。其他試劑為國產(chǎn)分析純。

冠突散囊菌液態(tài)基礎(chǔ)培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，蒸餾水1 L。

1.2 儀器與設(shè)備

ZQPL-200全溫振蕩培養(yǎng)箱：天津市萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司；LMQC型立式滅菌鍋：山東新華醫(yī)療器械股份有限公司SW-CJ-2G雙人單面（水平）凈化工作臺：江蘇通凈凈化設(shè)備有限公司；TP-620A電子天平：湘儀天平儀器設(shè)備有限公司；XMTD 數(shù)顯恒溫水浴鍋：上海浦東物理光學(xué)儀器廠；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；FD-1A-50冷凍干燥機(jī)：北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；CF16RXⅡ型高速冷凍離心機(jī)、UH5300型分光光度計(jì)：日本株式會社日立高新技術(shù)科學(xué)有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 冠突散囊菌胞外黑色素發(fā)酵液的制備

黑色素發(fā)酵液的制備：取活化后的冠突散囊菌菌種接種于裝有120 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，置28 ℃搖床中180 r/min培養(yǎng)10 d，過濾得冠突散囊菌發(fā)酵液。

1.3.2 黑色素的提取及含量的測定

黑色素的提?。簻?zhǔn)確量取冠突散囊菌發(fā)酵液50 mL，加入一定量的NaOH溶液，在一定溫度水浴中攪拌提取，趁熱過濾，再酸沉（用6 mol/L鹽酸調(diào)濾液至一定pH后置于一定溫度水浴中靜置4 h，使冠突散囊菌胞外黑色素絮凝使其沉淀），然后離心去上清液得到黑色沉淀物，用蒸餾水洗至中性，冷凍干燥后的到黑色素粗品，依次采用乙酸乙酯、氯仿和乙醇分別對黑色素粗品進(jìn)行萃取提純，冷凍干燥后得到冠突散囊菌胞外黑色素。

企業(yè)成本主要是指企業(yè)在生產(chǎn)、經(jīng)營的過程中，產(chǎn)生的經(jīng)濟(jì)支出為整體成本。對企業(yè)發(fā)展過程中的經(jīng)濟(jì)支出進(jìn)行詳細(xì)的規(guī)劃稱之為企業(yè)成本核算。企業(yè)在生產(chǎn)以及發(fā)展過程中對經(jīng)濟(jì)支出進(jìn)行詳細(xì)計(jì)算，主要是為企業(yè)領(lǐng)導(dǎo)提供現(xiàn)有的資金流動數(shù)量，使其為企業(yè)發(fā)展的下一步做出詳細(xì)計(jì)劃。并且，有效的成本核算能夠幫助企業(yè)領(lǐng)導(dǎo)穩(wěn)定資金流，以此指引企業(yè)未來的發(fā)展方向。同時，當(dāng)企業(yè)領(lǐng)導(dǎo)要做出重大經(jīng)營決定時，通過會計(jì)成本核算，幫助企業(yè)領(lǐng)導(dǎo)完善決定，促進(jìn)企業(yè)進(jìn)行健康發(fā)展。

黑色素含量的計(jì)算公式如下：

式中：M為提取得到的黑色素質(zhì)量，mg；V為發(fā)酵液體積，mL。

1.3.3 冠突散囊菌胞外黑色素提取單因素試驗(yàn)

NaOH濃度對冠突散囊菌胞外黑色素含量的影響：準(zhǔn)確量取冠突散囊菌發(fā)酵液100 mL，固定提取溫度為50 ℃，酸沉pH值為2，發(fā)酵液與NaOH體積比（料液比）1∶1.0（V/V），分別測定NaOH濃度為0.1mol/L、0.5mol/L、1.0mol/L、1.5mol/L、2 mol/L對冠突散囊菌黑色素含量的影響。每個處理組3個重復(fù)。

提取溫度對冠突散囊菌胞外黑色素含量的影響：準(zhǔn)確量取冠突散囊菌發(fā)酵液100 mL，固定NaOH濃度為1.0mol/L，酸沉pH值為2，料液比為1∶1.0（V/V），分別測定提取溫度為40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃對冠突散囊菌黑色素含量的影響。每個處理組3個重復(fù)。

酸沉pH對冠突散囊菌胞外黑色素含量的影響：準(zhǔn)確量取冠突散囊菌發(fā)酵液100 mL，固定NaOH濃度為1.0 mol/L，提取溫度為50 ℃，料液比為1∶1.0（V/V），分別測定酸沉pH為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5對冠突散囊菌黑色素含量的影響。每個處理組3個重復(fù)。

料液比對冠突散囊菌胞外黑色素含量的影響：準(zhǔn)確量取冠突散囊菌發(fā)酵液100 mL，固定NaOH濃度為1.0 mol/L，提取溫度為50 ℃，酸沉pH為2.0，分別測定料液比為1∶0.5、1∶1.0、1∶2.0、1∶3.0、1∶4.0（V/V）對冠突散囊菌黑色素含量的影響。每個處理組3個重復(fù)。

在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，以NaOH濃度（A）、提取溫度（B）、酸沉pH（C）和料液比（D）作自變量，進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，以冠突散囊菌黑色素含量（Y）為響應(yīng)值，確定堿法提取冠突散囊菌黑色素的最佳工藝參數(shù)。試驗(yàn)因素水平編碼見表1。

表1 黑色素提取工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology for melanin extraction process optimization

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

利用Origin 8.5、Design-Expert 8.0和SPSS 18.0數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 NaOH濃度對冠突散囊菌胞外黑色素含量的影響

由圖1得知，隨著NaOH濃度的增大，黑色素含量也不斷增大，當(dāng)NaOH濃度增大至1.0 mol/L時取得最大值1.248 mg/mL，此后黑色素含量隨著NaOH濃度的增大而減小，可能是因?yàn)镹aOH濃度的增大可以提取更多的黑色素，但濃度過高時，可能會浸提出發(fā)酵液中的其他成分，這些成分與黑色素發(fā)生反應(yīng)，不利于黑色素的提取[19-21]。因此，最適NaOH濃度為1.0 mol/L。

圖1 NaOH濃度對冠突散囊菌胞外黑色素含量的影響Fig.1 Effect of NaOH concentration on extracellular melanin contents of Eurotium cristatum

2.2 提取溫度對冠突散囊菌胞外黑色素含量的影響

由圖2得知，隨著提取溫度的升高，黑色素含量也不斷增大，當(dāng)提取溫度升高至70 ℃時取得最大值1.821 mg/mL，此后黑色素含量隨著提取溫度的升高而減小，可能是由于當(dāng)提取溫度過高時，冠突散囊菌胞外黑色素的高分子結(jié)構(gòu)遭到破壞導(dǎo)致提取效果不佳[22]，而且過高的溫度可能會造成蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等雜質(zhì)的溶出，給黑色素進(jìn)一步的純化帶來影響[23]。因此，最適提取溫度為70 ℃。

圖2 提取溫度對冠突散囊菌胞外黑色素含量的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on extracellular melanin contents of Eurotium cristatum

2.3 酸沉pH對冠突散囊菌胞外黑色素含量的影響

由圖3得知，隨著pH的升高，黑色素含量也不斷增大，當(dāng)pH為2.5時取得最大值2.006 mg/mL，此后黑色素含量隨著pH的升高而減小，可能是由于當(dāng)pH＜2.0時，冠突散囊菌胞外黑色素在強(qiáng)酸條件下不穩(wěn)定結(jié)構(gòu)遭到破壞，當(dāng)pH＞3.0時，不能將黑色素全部沉降析出[24]，故過高或過低的酸沉pH都不利于冠突散囊菌黑色素的提取。因此，最適酸沉pH值為2.5。

圖3 色素酸沉pH值對冠突散囊菌胞外黑色素含量的影響Fig.3 Effect of acid pigment deposition pH value on extracellular melanin content of Eurotium cristatum

2.4 料液比對冠突散囊菌胞外黑色素含量的影響

由圖4得知，隨著料液比的變化，黑色素含量也不斷增大，當(dāng)料液比為1∶1.0（V/V）時取得最大值1.534 mg/mL，當(dāng)料液比為1∶1.0（V/V）時黑色素含量與料液比為1∶1.0（V/V）時無顯著差異，此后黑色素含量隨著料液比的變化而減小，可能是由于當(dāng)提取溶劑過少時，短時間內(nèi)黑色素的溶解達(dá)到平衡，不利于黑色素的溶出[25]，提取溶劑過多時，可能會溶出其他雜質(zhì)，影響下一步的酸沉[26]。因此，最適料液比為1∶1.0（V/V）。

圖4 發(fā)酵液與NaOH溶液對冠突散囊菌胞外黑色素含量的影響Fig.4 Effect of fermentation broth to NaOH ratio on extracellular melanin content of Eurotium cristatum

2.5 響應(yīng)面試驗(yàn)

以NaOH濃度（A）、提取溫度（B）、酸沉pH（C）和料液比（D）為自變因素，黑色素含量（Y）為響應(yīng)值，采用Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法優(yōu)化提取條件，結(jié)果見表2。

表2 黑色素提取工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Design and results of response surface methodology for melanin extraction process optimization

利用Design-Expert 8.0軟件對響應(yīng)面結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合，對表2的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到的模型為多項(xiàng)回歸方程，得到二次多項(xiàng)回歸方程：

為了檢測以上方程的可靠性，對上述回歸模型進(jìn)行方差分析，并對模型系數(shù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果見表3。由表3方差分析結(jié)果可知，模型的F=68.12，P＜0.000 1差異極顯著，并且失擬項(xiàng)P=0.472 2＞0.05，故說明該模型是顯著的。由表3可知，NaOH濃度、提到溫度、酸沉pH和料液比對含量影響均顯著（P＜0.05）；對含量影響程度為B（提到溫度）＞D（料液比）＞A（NaOH濃度）＞C（酸沉pH）。交互項(xiàng)AB、AD、BD、CD對結(jié)果影響顯著（P＜0.05），二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2對結(jié)果影響極顯著（P＜0.01）。

響應(yīng)面優(yōu)化模型因素（NaOH濃度、提取溫度、酸沉pH和料液比）兩兩交互作用對含量影響的響應(yīng)面及等高線見圖5。

響應(yīng)面及等高線的形狀可以分析出隨著各因素水平的升高或延長，冠突散囊菌胞外黑色素含量均呈現(xiàn)先增大后減少的變化特征。并且，響應(yīng)面走勢的陡峭程度和等高線的形狀可以出反應(yīng)兩因素之間作用的顯著程度。其中，響應(yīng)面走勢越陡，等高線的形狀越偏向橢圓表明兩因素之間的交互作用越顯著。由圖5可知，溫度和料液比之間的交互作用最顯著，且等高線沿提取溫度軸變化更加密集，而沿料液比軸變化相對稀疏，最后結(jié)合響應(yīng)面的陡峭程度得出提取溫度對冠突散囊菌胞外黑色素含量的影響要大于料液比。同理可以得出酸沉pH對冠突散囊菌胞外黑色素含量的影響要低于NaOH濃度，而NaOH濃度對冠突散囊菌胞外黑色素含量的影響要低于提取溫度和料液比，這與表3方差分析結(jié)果一致。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析Table 3 Variance analysis of response surface methodology

圖5 各因素交互作用對冠突散囊菌胞外黑色素含量影響的響應(yīng)面及等高線Fig.5 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factor on extracellular melanin content of Eurotium cristatum

根據(jù)Design-Expert軟件得出在NaOH濃度、溫度、pH和料液比交互影響下，最優(yōu)提取工藝為NaOH濃度1.066 mol/L，提取溫度74.386 ℃，酸沉pH值2.572，料液比1∶1.441（V/V），在此條件下模型預(yù)測的產(chǎn)量為4.011 mg/mL?？紤]到操作的可行性，將最優(yōu)提取工藝修改為NaOH濃度為1 mol/L，提取溫度為74 ℃，pH為2.5，料液比為1∶1.4（V/V）并進(jìn)行驗(yàn)證性試驗(yàn)，在該條件下黑色素含量為3.982 mg/mL，與理論值相比，誤差為0.72%。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)在單因素的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法對堿法提取冠突散囊菌胞外黑色素的條件進(jìn)行了優(yōu)化，并建立了可靠的二次多項(xiàng)模型。通過方差分析表明，模型的擬合度較好，得到最優(yōu)提取工藝為NaOH濃度為1 mol/L，提取溫度為74 ℃，酸沉pH為2.5，料液比為1∶1.4（V/V）。采用該工藝進(jìn)行驗(yàn)證，在最優(yōu)提取條件下，冠突散囊菌胞外黑色素提取達(dá)到最大值3.982 mg/mL，與預(yù)測值基本吻合，說明試驗(yàn)得到的模型有效且可靠。