金黎明，王曉彤，宮小明，權(quán)春善，趙 晶，侯熙彥

（1.大連民族大學(xué) 生物技術(shù)與資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116605；2.濰坊出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東 濰坊 261041）

黃曲霉（Aspergillus flauvs）是一種世界范圍常見的許多重要農(nóng)作物以及動(dòng)物的共同致病菌，由于其產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物—黃曲霉毒素具有極強(qiáng)的致癌、致突變和致畸作用，尤其是黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）毒性最強(qiáng)、危害最大，被世界衛(wèi)生組織列為毒物之首，定為IA類致癌物質(zhì)[1-2]，因此，黃曲霉的防治仍然是亟需解決的問題。目前，糧食和食品中黃曲霉防治的方法主要有物理方法（如吸附[3]、萃取[4]、熱處理[5]、射線處理[6]等）、化學(xué)方法[7]、加強(qiáng)采后貯藏管理和生物防治等，其中，生物防治技術(shù)被認(rèn)為是最有前途和最有效的方法[8-9]。

近年來發(fā)現(xiàn)的能有效防治黃曲霉的微生物主要有芽孢桿菌（Bacillus）、乳桿菌（Lactobacillus）、假單胞菌（Pseudomonas）、扁座殼孢（Aschersonia placenta）等。徐進(jìn)等[10]研究發(fā)現(xiàn)，乳桿菌培養(yǎng)液對(duì)黃曲霉孢子萌發(fā)具有顯著的抑制作用；曹冬梅等[11]將彎曲乳酸桿菌（Lactobacillus curvatus）與黃曲霉（Aspergillus flavus）共培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)黃曲霉菌絲產(chǎn)量明顯降低；郭艷萍等[12]以泡菜、新鮮豬腸、豆?jié){渣、雞腸道內(nèi)容物為材料，采用牛津杯法篩選出6株對(duì)黃曲霉的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用的拮抗菌株，其中，3株為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），2株為消化乳桿菌（Lactobacillus alimentarius），1株為亞利桑那乳桿菌（Lactobacillus arizonenensis）；GOURAMA H等[13]研究表明，市售的青貯飼料接種植物乳桿菌、保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）和嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）的混合菌種，對(duì)黃曲霉具有抗菌活性；DEY R等[14]研究發(fā)現(xiàn)，從花生根際篩選的假單胞菌對(duì)黃曲霉具有防治效果；潘潔茹等[15]從福建省建甌市柑桔園分離篩選出一株蟲生真菌，扁座殼孢Jos009，用濾紙片法研究了其胞外代謝產(chǎn)物對(duì)黃曲霉菌生長(zhǎng)的抑制作用，結(jié)果表明抑制作用明顯，抑菌圈直徑達(dá)17 mm。其中，關(guān)于芽孢桿菌的報(bào)道最多。徐銘乾等[16]篩選出一株能夠抑制黃曲霉生長(zhǎng)的解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）HSP-5；李俊峰等[17]以煙臺(tái)黃曲霉污染區(qū)域土壤為材料，采用稀釋分離法和瓊脂擴(kuò)散法，篩選到1株對(duì)黃曲霉有抑制作用的空氣芽孢桿菌（Bacillus aerius）Y-17-3；涂彩虹等[18]從土壤中分離純化出一株具有黃曲霉拮抗活性的枯草芽孢桿菌，該菌株的次生代謝產(chǎn)物具有抑制黃曲霉生長(zhǎng)的效果，抑菌率可達(dá)63%；PETCHKONGKAEW A等[19]將從泰國(guó)北部的大豆和新鮮豆豉分離出來的23株芽孢桿菌與黃曲霉共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)芽孢桿菌都可抑制黃曲霉生長(zhǎng)，效果最好的兩種菌株分別為枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）。XIA X H等[20]分離到一株枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）JSW-1，對(duì)黃曲霉的抑制率為58.3%。AFSHARMANESH H等[21]研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌UTB1可抑制黃曲霉孢子的萌發(fā)，抑制率為39.45%；但是，目前仍然存在抑制效果差的的問題。

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtillis）是一類常見的安全性較高的革蘭氏陽(yáng)性菌，具有多種抑菌作用。本研究以從花生原產(chǎn)地土壤中篩選得到的1株對(duì)黃曲霉具有較強(qiáng)拮抗作用的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）21-1-2為研究對(duì)象，抑菌圈直徑為響應(yīng)值，通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)其發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，為進(jìn)一步研究該菌株的抗菌活性物質(zhì)及其相關(guān)次級(jí)代謝產(chǎn)物奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

黃曲霉（Aspergillus flavus）（保藏號(hào)CGMCC3.2890）：中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心；枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）21-1-2：濰坊出入境檢驗(yàn)檢疫局。

1.1.2 試劑

胰蛋白胨、瓊脂、酵母提取物（均為生化試劑）：北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司；氯化鈉、無(wú)水乙醇（均為分析純）：天津科密歐化學(xué)試劑有限公司。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：土豆去皮切塊，每200 g加入500 mL去離子水，煮沸30 min。雙層紗布過濾后，加入20 g蔗糖，20 g瓊脂粉，加去離子水至1 L；115 ℃條件下高壓滅菌30 min。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉5 g，瓊脂20g，去離子水1L，pH7.0；121℃條件下高壓滅菌20min。LB液體培養(yǎng)基中不添加瓊脂。

1.2 儀器與設(shè)備

S-4800型掃描電子顯微鏡：日本Hitachi公司；JA12002型電子天平：精密科學(xué)儀器公司；MLS-3020型濕熱高壓滅菌器：日本SANYO公司；BUCHI Rota vapor R-200型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司；SW-OJ-2FD型潔凈工作臺(tái)：蘇州安泰安氣技術(shù)有限公司；MT-180B型生化恒溫培養(yǎng)箱：上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；HWY111型恒溫培養(yǎng)振蕩器：智誠(chéng)分析儀器制造公司。

1.3 方法

1.3.1 黃曲霉孢子的制備

將黃曲霉菌株接種到PDA斜面，28 ℃條件下培養(yǎng)6 d后加入4 mL 0.9%的無(wú)菌生理鹽水，充分振蕩后濾掉菌絲，調(diào)整孢子濃度為1×107個(gè)/mL，待用。

1.3.2 拮抗黃曲霉活性的測(cè)定

采用濾紙片法[25]測(cè)定抑菌活性。具體操作：取100 μL制備好的黃曲霉孢子液均勻涂布于PDA平板。將Bacillus subtilis21-1-2發(fā)酵液離心（13 000 r/min，10 min），去除菌體，收集上清液過0.22μm無(wú)菌微孔濾膜，取上清液100μL緩慢滴于涂布有黃曲霉的培養(yǎng)皿中的8mm濾紙片上，28℃恒溫培養(yǎng)48 h，用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑，平行試驗(yàn)3次，取平均值。

1.3.3 枯草芽孢桿菌21-1-2培養(yǎng)條件優(yōu)化

初始發(fā)酵條件：將Bacillus subtilis21-1-2按1%（V/V）的接種量接種于LB液體培養(yǎng)基，初始發(fā)酵條件為培養(yǎng)溫度37 ℃、初始pH 7.0、搖床轉(zhuǎn)速180 r/min、培養(yǎng)時(shí)間36 h。

單因素試驗(yàn)：采用單因素輪換法，依次考察培養(yǎng)時(shí)間（12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h、84 h、96 h）、培養(yǎng)溫度（31 ℃、33 ℃、35 ℃、37 ℃、39 ℃）、初始pH值（3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0）、轉(zhuǎn)速（140 r/min、160 r/min、180 r/min、200 r/min、220 r/min）對(duì)Bacillus subtilis21-1-2拮抗黃曲霉活性的影響。

響應(yīng)面試驗(yàn)：在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以抑菌圈直徑（Y）為響應(yīng)值，選取培養(yǎng)時(shí)間（A）、培養(yǎng)溫度（B）、初始pH值（C）及轉(zhuǎn)速（D）為考察因素，根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)4因素3水平的Box-Behnken試驗(yàn)[22]，以-1、0、1分別代表自變量的低、中、高水平。各因素與水平見表1。

表1 枯草芽孢桿菌21-1-2培養(yǎng)條件優(yōu)化Box-Behnken試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken tests for culture conditions optimization of Bacillus subtilis 21-1-2

采用Design-Expert.V 8.0.6軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸擬合，得到多元二次回歸方程，分析各因素的主效應(yīng)和交互效應(yīng)，依據(jù)回歸方程繪制響應(yīng)面立體分析圖，得出響應(yīng)面規(guī)范分析結(jié)果，確定最佳培養(yǎng)條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 枯草芽孢桿菌21-1-2培養(yǎng)條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)Bacillus subtilis21-1-2拮抗黃曲霉活性的影響

培養(yǎng)時(shí)間對(duì)Bacillus subtilis21-1-2拮抗黃曲霉活性的影響見圖1。由圖1可知，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，抑菌圈直徑呈先增大后減小的趨勢(shì)，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為72 h時(shí)，抑菌圈直徑最大，為23.68 mm。因此，確定Bacillus subtilis21-1-2的最適培養(yǎng)時(shí)間為72 h。

圖1 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)枯草芽孢桿菌21-1-2拮抗黃曲霉活性的影響Fig.1 Effect of culture time on the activity of Bacillus subtilis 21-1-2 against Aspergillus flavus

2.1.2 培養(yǎng)溫度對(duì)Bacillus subtilis21-1-2拮抗黃曲霉活性的影響

培養(yǎng)溫度對(duì)Bacillus subtilis21-1-2拮抗黃曲霉活性的影響見圖2。由圖2可知，隨著培養(yǎng)溫度的升高，抑菌圈直徑呈先增大后減小的趨勢(shì)，當(dāng)培養(yǎng)溫度為37 ℃時(shí)，抑菌圈直徑最大，為23.87 mm。因此，確定Bacillus subtilis21-1-2的最適培養(yǎng)溫度為37 ℃。

圖2 培養(yǎng)溫度對(duì)枯草芽孢桿菌21-1-2拮抗黃曲霉活性的影響Fig.2 Effect of culture temperature on the activity of Bacillus subtilis 21-1-2 against Aspergillus flavus

2.1.3 初始pH值對(duì)Bacillus subtilis21-1-2拮抗黃曲霉活性的影響

圖3 初始pH值對(duì)枯草芽孢桿菌21-1-2拮抗黃曲霉活性的影響Fig.3 Effect of initial pH on the activity of Bacillus subtilis 21-1-2 against Aspergillus flavus

初始pH值對(duì)Bacillus subtilis21-1-2拮抗黃曲霉活性的影響見圖3。由圖3可知，隨著初始pH值的增加，抑菌圈直徑呈先增大后減小的趨勢(shì)，當(dāng)初始pH值為7.0時(shí)，抑菌圈直徑最大，為24.10 mm。因此，確定Bacillus subtilis21-1-2的最適初始pH值為7.0。

2.1.4 轉(zhuǎn)速對(duì)Bacillus subtilis21-1-2拮抗黃曲霉活性的影響

轉(zhuǎn)速對(duì)Bacillus subtilis21-1-2拮抗黃曲霉活性的影響見圖4。由圖4可知，隨著轉(zhuǎn)速的增加，抑菌圈直徑呈先增大后減小的趨勢(shì)，當(dāng)轉(zhuǎn)速為180 r/min時(shí)，抑菌圈直徑最大，為24.33 mm。因此，確定Bacillus subtilis21-1-2的最適轉(zhuǎn)速為180 r/min。

圖4 轉(zhuǎn)速對(duì)枯草芽孢桿菌21-1-2拮抗黃曲霉活性的影響Fig.4 Effect of shaking speed on the activity of Bacillus subtilis 21-1-2 against Aspergillus flavus

2.2 枯草芽孢桿菌21-1-2培養(yǎng)條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

響應(yīng)面法常被應(yīng)用在多個(gè)影響因素共同存在的優(yōu)化研究工作中，此方法與傳統(tǒng)方法相比，具有節(jié)約時(shí)間、空間以及原材料的優(yōu)點(diǎn)[23]。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以抑菌圈直徑（Y）為響應(yīng)值，培養(yǎng)時(shí)間（A）、培養(yǎng)溫度（B）、初始pH值（C）及轉(zhuǎn)速（D）為考察因素，采用響應(yīng)面分析法進(jìn)行4因素3水平試驗(yàn)，結(jié)果與分析見表2，回歸模型的方差分析見表3。

采用Design-expert.V 8.0.6軟件對(duì)表2的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合，得到抑菌圈直徑（Y）對(duì)自變量培養(yǎng)時(shí)間（A）、培養(yǎng)溫度（B）、初始pH值（C）及轉(zhuǎn)速（D）的二次回歸方程：

由表3可知，模型的P值＜0.01，極顯著，說明模型構(gòu)建成功，能反映響應(yīng)值的變化。失擬項(xiàng)P值＞0.05，回歸方程擬合效果較好，模型選擇恰當(dāng)。決定系數(shù)R2=0.924 5，調(diào)整決定系數(shù)R2adj=0.621 4，說明該模型的預(yù)測(cè)值與實(shí)際值具有較好的擬合性，可以用此模型對(duì)抑菌圈直徑進(jìn)行預(yù)測(cè)。各因素對(duì)抑菌圈直徑影響的主次順序?yàn)锳＞B＞D＞C，其中，交互項(xiàng)BC、CD、二次項(xiàng)A2、B2、D2對(duì)結(jié)果影響極顯著（P＜0.01），一次項(xiàng)A、交互項(xiàng)AD、BD、二次項(xiàng)C2對(duì)結(jié)果影響顯著（P＜0.05），而其他項(xiàng)對(duì)結(jié)果影響不顯著（P＞0.05）。

表2 枯草芽孢桿菌21-1-2培養(yǎng)條件優(yōu)化Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of Box-Behnken tests for culture condition optimization of Bacillus subtilis 21-1-2

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

采用Design-expert.V 8.0.6軟件依據(jù)回歸方程繪制響應(yīng)面及等高線，結(jié)果見圖5。

由圖5可知，隨著各因素水平的增大，響應(yīng)值呈先升高后降低的趨勢(shì)，說明存在最大值。培養(yǎng)溫度和初始pH值、初始pH值和轉(zhuǎn)速的等高線均為明顯的橢圓，說明培養(yǎng)溫度和初始pH值、初始pH值和轉(zhuǎn)速的交互作用對(duì)抑菌直徑影響極顯著。

圖5 各因素交互作用對(duì)枯草芽孢桿菌21-1-2抗黃曲霉活性影響的響應(yīng)面及等高線Fig.5 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factor on the activity of Bacillus subtilis 21-1-2 against Aspergillus flavus

通過Design-Expert.V 8.0.6軟件對(duì)模型進(jìn)行優(yōu)化求解，得到Bacillussubtilis21-1-2的最佳培養(yǎng)條件為培養(yǎng)時(shí)間72.16 h、培養(yǎng)溫度為36.31 ℃、初始pH值6.65、轉(zhuǎn)速187.89 r/min，預(yù)測(cè)的抑菌直徑為27.76 mm?？紤]到實(shí)際操作性，將最佳培養(yǎng)條件修訂為培養(yǎng)時(shí)間72 h，培養(yǎng)溫度36 ℃，初始pH值6.7，搖床轉(zhuǎn)速188 r/min。為了檢驗(yàn)Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果的可靠性，在最佳培養(yǎng)條件下進(jìn)行3組平行驗(yàn)證試驗(yàn)。結(jié)果表明，Bacillus subtilis21-1-2對(duì)黃曲霉抑菌直徑達(dá)到27.42 mm，與預(yù)測(cè)理論值相對(duì)誤差較小，說明回歸模型預(yù)測(cè)值具有良好符合性，結(jié)果可信。

3 結(jié)論

通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)確定枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）21-1-2拮抗黃曲霉的最佳培養(yǎng)條件為培養(yǎng)時(shí)間為72 h，培養(yǎng)溫度36 ℃，初始pH值6.7，搖床轉(zhuǎn)速188 r/min。在此優(yōu)化條件下，Bacillus subtilis21-1-2抑菌圈直徑為27.42 mm，是優(yōu)化前（14.36 mm）的1.9倍。