王越珉，雷喜梅，鄔 麗，伍義行，葉子弘，俞曉平

(中國計量大學 生命科學學院 浙江省生物計量及檢驗檢疫技術(shù)重點實驗室，浙江 杭州 310018)

2019年12月下旬，中國武漢出現(xiàn)了SARS樣疾病感染者?；颊弑憩F(xiàn)出發(fā)燒、咳嗽、乏力等癥狀，重癥患者可出現(xiàn)急性呼吸衰竭綜合征[1]。2020年1月11日，中國衛(wèi)生健康委員會將該致病原稱為新型冠狀病毒(2019-nCoV)。2月11日，WHO在全球研究與創(chuàng)新論壇上宣布將新冠肺炎正式命名為2019冠狀病毒病(corona virus disease 2019，COVID-19)。同時，國際病毒分類委員會的冠狀病毒研究小組也正式宣布，將2019-nCoV定名為嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2(SARS-CoV-2，severe acute respiratory syndrome coronavirus 2)[2]。雖然，SARS-CoV-2較SARS和中東呼吸綜合征(MERS，middle east respiratory syndrome)的病死率低(分別為9.6%和34.4%)，但該病毒傳染性強、傳染途徑隱蔽、傳播速度快。截至3月19日，我國累計確診病例81202例，其他國家確診病例124099例，共計死亡病例逾8000人，數(shù)字遠超2003年暴發(fā)的SARS(確診8069人，死亡774人)和2012年的MERS疫情(確診2494人，死亡858人)[3，4]。目前，全世界166個國家或地區(qū)已發(fā)現(xiàn)有新冠肺炎確診病例。該病毒在意大利、伊朗、西班牙、德國及美國等國家大范圍傳播，確診患者正在大幅增加，其中意大利患者病死率已達7.9%。

COVID-19病例流行病學研究表明，我國SARS-CoV-2首次發(fā)現(xiàn)于武漢華南海鮮批發(fā)市場[1]。病毒可通過飛沫、直接接觸或氣溶膠傳播，存在糞口傳播風險[5]，無癥狀病毒攜帶者也可傳播病毒，這極大地增加了COVID-19大流行的危險[6]。盡管過去幾十年，科學家們對人冠狀病毒開展了大量研究，但其特異性疫苗和有效治療方法迄今仍在試驗階段，COVID-19的有效疫苗和治療策略也在研發(fā)和評估中。因此，深入清晰地了解SARS-CoV-2的病原學特征，建立靈敏、特異、穩(wěn)定的檢測方法是現(xiàn)階段做好疫情防控、病毒檢測和病程監(jiān)測的基礎和關鍵。本文根據(jù)現(xiàn)有實驗證據(jù)總結(jié)SARS-CoV-2的病原特征，并對病毒分離鑒定、核酸檢測及蛋白檢測等方法進行分析，以期對相關檢測技術(shù)的研發(fā)和COVID-19的有效防控提供參考。

1 病毒的病原學特征

冠狀病毒(coronaviruses，CoVs)是已知具有最大基因組、有包膜的單股正鏈RNA病毒，屬于冠狀病毒科。目前共鑒定出SARS-CoV-2等7種可引起人類疾病的冠狀病毒，其中229E、HKU1、OC43和NL63為低致病性病毒，主要引起上呼吸道感染，造成典型的溫和性呼吸道癥狀；SARS-CoV-2、SARS-CoV和MERS-CoV為高致病性冠狀病毒，主要感染下呼吸道，引起致死性肺炎[3]。

冠狀病毒科分為冠狀病毒亞科和曲狀病毒亞科，其中冠狀病毒亞科包含α、β和γ等3個屬。幾乎所有的α屬、β屬冠狀病毒均有哺乳動物宿主，而γ屬冠狀病毒分離自禽類。SARS-CoV-2屬于冠狀病毒亞科β屬，為有囊膜的單股正鏈RNA病毒，病毒直徑約為60～140 nm，圓形或橢圓形。當前關于SARS-CoV-2的物理化學性質(zhì)還不甚清楚。根據(jù)SARS-CoV和MERS-CoV的研究推測其對紫外線和熱滅活較敏感。

SARS-CoV-2的基因組包括29891 nt(GenBank no.MN908947)，編碼9860個氨基酸，4個結(jié)構(gòu)蛋白：刺突蛋白(S蛋白)、膜蛋白(M蛋白)、囊膜蛋白(E蛋白)及核衣殼蛋白(N蛋白)(如圖1)。分子進化分析表明，SARS-CoV-2與云南來源的蝙蝠冠狀病毒高度相似(96.3%的序列相似性)，但與SARS-CoV及MERS-CoV則較遠，分別約79%和50%的序列相似性[2]。研究顯示，SARS-CoV-2在疫情發(fā)生過程中已產(chǎn)生了149個點突變，演化出L和S兩個亞型，并具有顯著差異的地域和人群分布比例[7]。L亞型占檢測樣品的70%，在武漢疫情暴發(fā)早期的樣本多為L亞型。

圖1 主要結(jié)構(gòu)蛋白編碼基因(S=刺突蛋白、E=囊膜蛋白、M=膜蛋白、N=核衣殼蛋白)和輔助蛋白ORF的位置[2]Figure 1 Location of major structural protein-encoding genes(S=Spike protein, E=Envelope protein, M=Membrane protein, N=Nucleocapsid protein) and accessory protein ORFs[2]

SARS-CoV-2包含ORF1ab、S、E、M、N等6個主要的功能性開放閱讀框(open reading frame，ORF)和ORF3b、OFR8等附屬基因。其中，S、M及E蛋白構(gòu)成病毒囊膜，是病毒免疫反應的主要表面抗原；N蛋白位于病毒核心，與病毒RNA結(jié)合，構(gòu)成核衣殼，其序列高度保守[8]。S蛋白會被宿主蛋白酶完全或部分裂解為S1和S2亞基。研究表明SARS-CoV-2的S2亞基高度保守，與SARS-CoV的S2亞基有99%的相似性。S1亞基含有2個結(jié)構(gòu)域，分別是位于N端的胞內(nèi)域和C端的細胞受體結(jié)合域。盡管SARS-CoV-2的S1亞基與SARS-CoV的S1亞基僅有約70%的相似性，但其同源建模顯示兩種病毒的受體結(jié)合域高度相似，均能通過結(jié)合廣泛表達于人肺泡上皮細胞的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(angiotensin converting enzyme 2，ACE2)感染細胞，且SARS-CoV-2結(jié)合ACE2的能力是SARS-CoV的10倍[9]。SARS-CoV-2甚至可以在結(jié)合宿主細胞后增強ACE2的表達，進而引起嚴重肺泡細胞損傷。這也在一定程度上解釋了，為什么SARS-CoV-2具有比SARS更強的傳播能力，能夠感染各個年齡階段的人群[10]。ACE2將可能成為SARS-CoV-2診治措施中的重要靶標。M蛋白是SARS-CoV-2中含量最高的蛋白，構(gòu)成病毒的整個外部形態(tài)。E蛋白含量則最少，在種屬間差異較大，但被單敲除后會影響病毒的感染。

研究表明，蝙蝠和禽類是冠狀病毒繁殖與進化的理想儲存宿主[11]。大部分冠狀病毒新成員，包括SARS-CoV以及其它4株α屬和3株β屬的冠狀病毒，均分離自蝙蝠。當前研究尚未明確SARS-CoV-2的宿主，但有證據(jù)顯示蝙蝠可能為其自然宿主，水貂或穿山甲可能為其中間宿主。盡快明確其中間宿主將對疫情的防控有重要意義。

2 檢測方法研究進展

由于新型冠狀病毒隱蔽性和感染性強的特點，急需靈敏、特異和穩(wěn)定的檢測方法以保障病毒感染的確診、患者治愈的判定和疫情的監(jiān)測。目前SARS-CoV-2檢測方法主要包括病毒分離鑒定、核酸檢測和蛋白檢測。

2.1 病毒分離鑒定

根據(jù)柯赫法則進行病毒分離培養(yǎng)與鑒定是確定新型冠狀病毒感染的重要檢測方法，也是后續(xù)開展SARS-CoV-2相關科研和診療工作的基礎。通過感染細胞、實驗動物等方法進行病毒分離純化與擴增，進一步噬斑純化得到病毒毒株后，研究人員結(jié)合電鏡觀察、測序分析和進化分析，判定病毒的種屬及分類地位。中國疾病預防控制中心和武漢病毒研究所石正麗團隊分別在2020年1月成功對新型冠狀病毒進行了分離和測序。之后國內(nèi)外多個團隊根據(jù)SARS-CoV培養(yǎng)經(jīng)驗，利用多種細胞(如人呼吸道上皮細胞、Vero E6和Huh-7細胞系等)實現(xiàn)了病毒的體外培養(yǎng)，并進一步發(fā)現(xiàn)，SARS-CoV-2在感染人呼吸道上皮細胞96 h后可觀察到細胞病變，但在Vero E6和Huh-7細胞感染6 d內(nèi)未見細胞病變的發(fā)生[1]。

分離鑒定不同地區(qū)、不同病程的病毒株對病毒致病機制研究和疫苗生產(chǎn)至關重要。但SARS-CoV-2分離培養(yǎng)技術(shù)難度高、周期長、安全性低，需要在高級別生物安全實驗室(BSL-3)進行，不適合于臨床檢測和病程監(jiān)測。

2.2 核酸檢測方法

核酸檢測作為病毒臨床檢測中的重要方法，常成為病毒性疾病確診的首要標準，在新冠肺炎疫情防控過程中起著重要作用。截至2020年2月27日，全球至少50家單位研發(fā)了SARS-CoV-2核酸檢測技術(shù)，并獲得突破性進展。全球科學家特別是中國科研工作者在本次疫情過程中付注了巨大努力，不斷縮短病毒核酸檢測周期，簡化核酸檢測流程。目前，SARS-CoV-2核酸檢測方法主要包括測序技術(shù)、PCR技術(shù)和等溫擴增技術(shù)。

2.2.1 核酸測序技術(shù)

利用先進測序技術(shù)解讀SARS-CoV-2的遺傳密碼，幫助了解病毒的來源和進化，是COVID-19患者確診的依據(jù)之一。目前已有相關的測序試劑盒被研發(fā)應用，如廣州萬孚生物技術(shù)股份有限公司基于半導體測序法研發(fā)的病毒全基因組靶向測序試劑盒，可在24 h內(nèi)完成96人份樣品檢測，平均測序深度為2 000；深圳華大基因股份有限公司基于聯(lián)合探針錨定聚合測序法研發(fā)的檢測試劑盒，能夠鑒別診斷多種呼吸道病原序列，實現(xiàn)病毒序列快速檢測。但是測序技術(shù)存在時間長、費用高等不足，不適用于大規(guī)模篩查。因此，SARS-CoV-2測序試劑盒市場占比較低。

目前，測序技術(shù)已經(jīng)發(fā)展到第四代。Nanopore技術(shù)是一種單分子實時測序技術(shù)，以單分子(DNA或RNA)通過生物納米孔的電流變化進行堿基測序，可結(jié)合小型實時測序設備進行實時長讀長測序，非常適合現(xiàn)場快速檢測，將是未來重要的發(fā)展方向。據(jù)報道，武漢大學聯(lián)合團隊已于2月29日針對SARS-CoV-2和40余種呼吸道病毒開發(fā)出納米孔靶向測序技術(shù)，實現(xiàn)了10 min完成高濃度樣品和4 h內(nèi)完成低濃度樣品的多種病毒篩查，并且病毒陽性檢出率較qPCR方法提高43.8%。該方法還可實現(xiàn)對新型冠狀病毒基因組突變情況實時監(jiān)測[12]。

2.2.2 PCR技術(shù)

聚合酶鏈式反應技術(shù)是通過擴增病毒特異性片段來檢測病毒的有無。實時RT-PCR和快速多重PCR不僅具有很高靈敏性和特異性，還能區(qū)分病毒類型和亞型，適用于多種類型的病毒樣品。與核酸測序技術(shù)一樣，PCR技術(shù)已作為SARS-CoV-2患者確診標準被寫入《新型冠狀病毒肺炎診療方案》。在檢測方法研發(fā)過程中，各團隊主要針對新型冠狀病毒基因組中ORF1ab、N和E等基因的保守區(qū)域設計擴增引物，以避免SARS-CoV或MERS-CoV的非特異性干擾。為提高特異性，國家衛(wèi)建委要求在一份樣品中針對病毒的兩個靶標(ORF1ab和N)進行特異性PCR檢測，若Ct值均小于37，則報告為陽性，病人確診感染。

2020年1月24日，由上海之江生物科技股份有限公司研發(fā)的SARS-CoV-2核酸檢測試劑盒成為首個經(jīng)法定檢測機構(gòu)檢定合格的新型冠狀病毒檢測產(chǎn)品，并在1月26日通過國家藥監(jiān)局審批。運用該試劑盒可在2 h左右完成一個樣品的檢測，有效減少患者確診時間和成本，但是仍存在假陰性率高等問題。為提高檢測靈敏度，中國計量科學研究院設計和優(yōu)化相應引物、探針、陰性對照、陽性對照、內(nèi)參基因，成功研發(fā)了SARS-CoV-2高靈敏數(shù)字PCR檢測方法，實現(xiàn)病毒的絕對定量，有效縮小檢測灰區(qū)、減少樣品雜質(zhì)影響。隨著病毒的全球蔓延，世界各地也開展了對SARS-CoV-2檢測技術(shù)的研發(fā)。其中日本杏林制藥通過優(yōu)化溫度調(diào)節(jié)系統(tǒng)，利用毛細管基連續(xù)流動PCR微流控裝置研發(fā)了微觀流體基因定量檢測裝置GeneSoc，將檢測時間縮短到15 min，可用于現(xiàn)場快速檢測。

2.2.3 等溫擴增技術(shù)

等溫擴增技術(shù)結(jié)合了PCR技術(shù)靈敏、特異的優(yōu)點，又不需要昂貴設備，且操作簡便，肉眼即可判定結(jié)果，是適合于現(xiàn)場檢測的快速核酸檢測技術(shù)。以環(huán)介導等溫擴增技術(shù)為例，該技術(shù)在具有鏈置換活性功能的DNA聚合酶作用下，將四條特異性引物與靶基因六個不同區(qū)域退火雜交，從而實現(xiàn)在等溫條件下擴增核酸序列，突破了傳統(tǒng)核酸檢測技術(shù)效率不夠高、昂貴、操作不便的瓶頸。

尹秀山博士團隊利用逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導等溫擴增技術(shù)檢測ORF1ab，在65 ℃恒溫條件下檢測限可低至10個拷貝，靈敏性達97.6%[13]。中國疾病預防控制中心與江蘇奇天基因生物科技有限公司則共同研發(fā)了新型冠狀病毒核酸重組酶介導擴增技術(shù)檢測試劑盒，可以在8～15 min完成樣品檢測。除此之外，基于恒溫擴增芯片法的首個多指標SARS-CoV-2檢測試劑盒于2月22日獲國家藥監(jiān)局批準。該試劑盒能在1.5 h內(nèi)對16人份樣品的6種呼吸道病毒核酸進行檢測，可有效鑒別2019冠狀病毒病患者，幫助患者獲得精準治療。

2.3 蛋白檢測方法

蛋白檢測在疫情發(fā)生初期受限于病毒抗原和抗體的獲得，研發(fā)速度慢于核酸檢測。該方法穩(wěn)定、便捷、快速，適用于大規(guī)模篩查和病程監(jiān)測，主要包括病毒抗原檢測和抗體檢測兩部分。蛋白檢測方法一般利用抗原抗體特異性結(jié)合的原理，其中以競爭法為主。這種方法是將病毒抗原或特異性抗體固定于固相載體上，作為固定相，以患者體液樣品作為液體相，通過液體相與固定相上抗原或特異性抗體發(fā)生相互作用進行檢測。在此過程中，體液中特異性抗體或病毒抗原相對于其他蛋白質(zhì)親和力更高、結(jié)合能力更強，能與固定相上的抗原或抗體特異性結(jié)合，最后配合特定的顯色方法進行樣品中病毒抗原或抗體檢測。

2.3.1 病毒抗原檢測方法

抗原檢測方法主要利用特異性抗體檢測病毒主要結(jié)構(gòu)蛋白，具有穩(wěn)定方便、操作簡單易行等特點，適用于現(xiàn)場篩查。被測抗原主要針對SARS-CoV-2病毒的表面結(jié)構(gòu)蛋白或者高度保守的蛋白，例如N蛋白、S蛋白等。但抗原檢測法受所用抗體的質(zhì)量、免疫原性等影響，對病毒抗原蛋白的檢測閾值有一定差異。病毒抗原檢測方法除了競爭法以外，還有雙抗夾心法，其原理為將捕獲抗體包被于固相載體上，與含有目標抗原的待檢樣品進行孵育，最后以特異性的標記抗體孵育，通過特定方式顯色后對結(jié)果進行分析。目前，已經(jīng)有關于SARS-CoV-2雙抗夾心法的報道。例如美康生物公司研發(fā)的新型冠狀病毒蛋白快速檢測試劑盒。該試劑盒利用固定在硝酸纖維膜檢測區(qū)帶上的抗體，捕獲樣本中的新型冠狀病毒蛋白抗原，與標記在納米顆粒上特異性抗體孵育，并運用納米顆粒的顯色作用，實現(xiàn)對特異性的新型冠狀病毒蛋白的定性檢測和快速篩查。

2.3.2 病毒抗體檢測方法

病毒抗體檢測方法是指利用病毒蛋白抗原為工具，檢測病毒感染后誘發(fā)機體產(chǎn)生的特異性抗體的方法。被測抗體包括針對病毒特異性的IgG和IgM。IgM是人體接觸抗原后最早產(chǎn)生的抗體，對于病原早期的檢測有指導意義；IgG由B細胞受到SARS-CoV-2病毒抗原刺激后，分化為漿細胞產(chǎn)生，過程較慢。同時會有一小部分B細胞分化為記憶B細胞。當機體再次接觸SARS-CoV-2病毒抗原時，記憶B細胞能迅速產(chǎn)生特異性IgG抗體。因此，對于早期的篩查常以IgM為檢測對象，針對于后期及回顧性檢測則常以IgG為檢測對象。在國家衛(wèi)健委第七版(診療方案)中，COVID-19的確診方法已從核酸檢測，擴展了針對SARS-CoV-2特異性IgM和IgG的抗體檢測。

目前，已經(jīng)有大量關于抗體檢測方法的報道。例如，鐘南山院士指導研發(fā)的基于檢測血液中SARS-CoV-2 IgM抗體的膠體金免疫層析試劑盒，據(jù)介紹只需一滴血15 min就可以出結(jié)果，該試劑盒檢測具有簡單高效的特點，打破了現(xiàn)有檢測對場所及人員的限制，縮短檢測用時，已經(jīng)與核酸檢測等技術(shù)聯(lián)合用于一線病毒感染的監(jiān)測評估。截至3月19日，國家藥品監(jiān)督管理局已經(jīng)審批通過8個抗體檢測試劑，包括五個膠體金法抗體檢測試劑、兩個磁微粒化學發(fā)光法抗體檢測試劑以及一個化學發(fā)光微粒子免疫檢測法抗體檢測試劑。

2.4 檢測結(jié)果比對和量值溯源

標準樣品(或標準物質(zhì))是不同實驗室檢測結(jié)果比對和量值溯源到國際單位的保障。新型冠狀病毒核酸和蛋白標準樣品(或標準物質(zhì))可用于該病毒核酸檢測方法、蛋白檢測方法、快速檢測試劑盒質(zhì)量控制與評價、實驗室測量結(jié)果量值溯源，以及病毒核酸或蛋白相關研究工作。

目前SARS-CoV-2核酸檢測是新冠病毒肺炎COVID-19病原學確診的主要依據(jù)，而該病毒核酸標準樣品(或標準物質(zhì))的研制及應用可以規(guī)范核酸檢測試劑的質(zhì)量控制和質(zhì)量評價，校正實驗室檢測結(jié)果，減少因試劑盒質(zhì)量問題等引起的檢測假陰性或假陽性結(jié)果。目前，國家標準物質(zhì)資源共享平臺已公布GBW(E)091089新型冠狀病毒核酸標準物質(zhì)的研制成功，為SARS-CoV-2核酸檢測標準化提供標準對照。

以公布的新型冠狀病毒基因為依據(jù)，重組真核表達并純化得到新冠病毒S、S1、N和宿主ACE2等主要蛋白，以其他國家一級生化標準物質(zhì)或標樣作為標準，采用同位素稀釋質(zhì)譜法進行定值并獲得標準物質(zhì)或標準樣品。蛋白(抗原或抗體)檢測結(jié)果常受試劑盒內(nèi)有效蛋白成分的影響，結(jié)果常不穩(wěn)定，其中影響檢測結(jié)果可靠性及檢測閾值的主要因素包括試劑盒中抗原或抗體的含量、穩(wěn)定性、免疫原性等。正常情況下蛋白檢測試劑盒、疫苗等從研發(fā)到臨床試驗再到拿證進入臨床應用要3～5年，甚至更長。但這次新型冠狀病毒病屬于重大突發(fā)，抗原或抗體試劑盒的研制需要在短期內(nèi)完成，試劑的優(yōu)化、質(zhì)控和靈敏度特異性測試等會有所欠缺，從而導致檢測結(jié)果的不穩(wěn)定。因此，需要標準樣品(或標準物質(zhì))對試劑盒的檢測準確度和精密度進行校準，對試劑盒生產(chǎn)過程進行質(zhì)量控制；同樣，標準樣品(或標準物質(zhì))可以檢測和比對病毒感染病程中不同階段以及后續(xù)疫苗的質(zhì)量評價過程中的蛋白含量。病毒相關蛋白標準樣品(或標準物質(zhì))為病毒檢測機構(gòu)資質(zhì)的認證認可提供支撐。目前，中國計量大學生命科學學院已聯(lián)合浙江大學附屬第四醫(yī)院進行了SARS-CoV-2多個蛋白標準樣品的研制和申報，建立了相應的同位素稀釋質(zhì)譜法等蛋白純度定值技術(shù)，并按照標準樣品制備規(guī)范進行穩(wěn)定性、均勻性檢測，完成不確定度評定，研發(fā)具有準確量值和溯源性的SARS-CoV-2蛋白標準樣品，將有力支撐COVID-19的研究和防控工作。

3 總結(jié)和展望

COVID-19暴發(fā)以來給中國及世界公共衛(wèi)生體系帶來了嚴峻挑戰(zhàn)。目前，疫情處于膠著狀態(tài)，仍需持續(xù)強化防控和實時監(jiān)測[3]。而靈敏、特異、穩(wěn)定的病毒檢測對疫情防控至關重要。其中病毒分離鑒定、核酸檢測和蛋白(抗原抗體)檢測等作為病原學檢測的主要手段，三者互為補充(如表1)，共同構(gòu)成了SARS-CoV-2檢測技術(shù)體系。截至2020年3月19日，國家藥品監(jiān)督管理局共批準了SARS-CoV-2核酸檢測試劑11個和抗體檢測試劑8個。

表1 新型冠狀病毒SARS-CoV-2檢測方法的比較Table 1 Comparison of detection methods for Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2

作為新發(fā)傳染病從形態(tài)學上進行病原確診的必需手段，病毒分離鑒定雖然在臨床診斷的直接應用中存在局限性，但是感染綜合診斷的重要依據(jù)，也是后續(xù)科學防治研究的基礎。核酸檢測是目前SARS-CoV-2診斷使用最廣泛的方法，該方法具有特異性強和靈敏性高的特點。但根據(jù)目前國家藥監(jiān)局批準的SARS-CoV-2核酸檢測試劑盒來看，臨床檢測中常出現(xiàn)假陰性結(jié)果。究其原因，可能主要與下列因素有關：1)核酸檢測技術(shù)本身局限性。目前批準的試劑盒基于熒光PCR法以及恒溫擴增芯片法和測序法，其原理主要針對病毒特異性基因序列設計，如果病毒目標序列區(qū)段發(fā)生突變，或者PCR抑制造成模板與引物無法匹配，則可能出現(xiàn)假陰性結(jié)果。2)樣品采集和處理問題。樣品采集時間、部位和方法不同，或者樣品前處理不當，可能因樣品病毒載量過低導致漏檢，比如臨床發(fā)現(xiàn)部分患者咽拭子核酸檢測為陰性，但其下呼吸道分泌物、肛拭子或血液標本中核酸檢測則是陽性[14]。3)病毒核酸穩(wěn)定性問題。SARS-CoV-2作為RNA病毒，其核酸本身較易降解，故無論樣品采集、保存還是運輸環(huán)節(jié)失當，均可因樣品中RNA降解，造成假陰性結(jié)果。4)核酸檢測質(zhì)控問題。迫于疫情防控急需，目前臨床核酸檢測試劑盒是國家藥監(jiān)局按照《醫(yī)療器械應急審批程序》快速審批的，試用前尚未按體外診斷試劑報批要求完成臨床試驗，可能其技術(shù)和質(zhì)控體系還有待完善；另外，核酸檢測儀器的校準也亟需加強。

基于核酸檢測的局限性，研發(fā)SARS-CoV-2蛋白(抗原和抗體)檢測技術(shù)及其試劑十分必要?？乖贵w檢測的關鍵是獲得高度靈敏和特異的抗原抗體，鑒于抗體產(chǎn)生和消失是一個動態(tài)過程，選擇合理的采樣時機非常關鍵，由于目前對SARS-CoV-2免疫有關問題缺乏深入系統(tǒng)的研究，給SARS-CoV-2抗原和抗體高質(zhì)量檢測試劑的研發(fā)帶來了困難。同時，蛋白檢測本身也存在多種影響因素：1)抗原交叉反應。存在與同源性較高的同科屬病毒發(fā)生交叉反應可能性，影響檢測結(jié)果判斷。2)血液成分干擾。血液標本中某些成分(如類風濕因子、非特異IgM、溶血所致的高濃度血紅蛋白等)可能干擾檢測結(jié)果，存在“假陽性”可能。3)抗原抗體感染早期不易檢出。由于感染早期抗原含量往往較低，而特異性抗體產(chǎn)生又存在窗口期，故在感染早期檢出率較低。4)檢測質(zhì)控問題。目前尚缺乏SARS-CoV-2蛋白有證標準品，量值準確性缺乏保障?？傊?，鑒于抗原抗體檢測的特點，其特異性和靈敏性相對于核酸檢測而言有所降低，但隨抗體在感染后顯著升高和持續(xù)存在，蛋白檢測可用于疑似病例、無癥狀病例檢測，以及康復患者監(jiān)測。更重要的是，還可通過病毒核酸、抗原和抗體聯(lián)合檢測，有利于縮短檢測窗口期，提高檢測陽性率，推動診斷前移，實現(xiàn)疑似患者快速診斷和密切接觸人群的現(xiàn)場篩查，對SARS-CoV-2感染疫情防控具有重要意義。

鑒于現(xiàn)有SARS-CoV-2檢測技術(shù)的局限性，建議今后可以加強以下三個方面的研究工作：1)蛋白標準樣品(或標準物質(zhì))研發(fā)。為SARS-CoV-2蛋白的精準檢測和量值溯源保駕護航。2)Sherlock檢測技術(shù)研發(fā)。該技術(shù)利用等溫擴增和CRISPR Cas13的“脫靶效應”，在病毒特異性CRISPR RNA的引導下，被病毒RNA激活，剪切報告基因；被剪切的報告基因?qū)⑴c試紙的陽性檢測線結(jié)合產(chǎn)生信號；報告基因若未被剪切，則會與試紙的陰性檢測線結(jié)合產(chǎn)生信號，從而給出檢測結(jié)果[15]。該方法結(jié)合了蛋白檢測和核酸檢測技術(shù)的優(yōu)點，有望為早期快速診斷提供新手段。3)完善全病程監(jiān)測技術(shù)體系。鑒于目前COIVD-19尚缺乏完善的病程監(jiān)測指標體系，從病毒感染和機體反應兩方面，建立包括抗原、抗體、細胞炎癥因子等在內(nèi)的全病程監(jiān)測指標體系及技術(shù)，對COIVD-19疫情防控、疾病治療和藥效評價具有重要促進作用。