朱鏈鏈，王麗瓊

（1.樂山職業(yè)技術(shù)學(xué)院，四川 樂山 614000；2.樂山市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，四川 樂山 614000）

感冒清片屬于抗感冒藥類中西藥復(fù)方制劑，由3 種西藥（對(duì)乙酰氨基酚、鹽酸嗎啉胍、馬來酸氯苯那敏）和6 種中藥（南板藍(lán)根、大青葉、金盞銀盤、崗梅、山芝麻、穿心蓮葉）制成，該類制劑應(yīng)用廣泛，但其不良反應(yīng)問題也居高不下［1］，業(yè)界大多認(rèn)為其原因是在臨床使用時(shí)易忽略所含化學(xué)成分，關(guān)鍵項(xiàng)目（如有關(guān)物質(zhì)、含有量均勻度、溶出度）缺失，故建議對(duì)該類藥物進(jìn)行再評(píng)價(jià)［2］。

文獻(xiàn)［3-8］報(bào)道，采用HPLC 法測(cè)定對(duì)乙酰氨基酚、鹽酸嗎啉胍、馬來酸氯苯那敏單一或多種成分含有量，但鹽酸嗎啉胍保留弱，易受溶劑峰干擾，而在流動(dòng)相中加入離子對(duì)試劑可使分離變好。本實(shí)驗(yàn)建立離子對(duì)反相高效液相色譜（ion-pair reversephase high performance liquid chromatography，IP-RPHPLC）法同時(shí)測(cè)定感冒清片中對(duì)乙酰氨基酚、鹽酸嗎啉胍、馬來酸氯苯那敏的含有量，并考察三者含有量均勻度，以期為該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260 高效液相色譜儀（配置四元泵、DAD 檢測(cè)器）；XS205 電子天平、FE28 PH計(jì)（瑞士梅特勒-托利多公司）；CQ-100B 超聲波清洗機(jī)（上海躍進(jìn)醫(yī)用光學(xué)器械廠）。

1.2 試劑與藥物 對(duì)乙酰氨基酚（100018-201610，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.9%）、鹽酸嗎啉胍（100483-200402，質(zhì)量分?jǐn)?shù)100%）、馬來酸氯苯那敏（100047-201507，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.7%）對(duì)照品均購自中國食品藥品檢定研究院。感冒清片（廣東一片天醫(yī)藥集團(tuán)制藥有限公司，批號(hào)171113、171208；廣東南國藥業(yè)有限公司，批號(hào)170606），每片含對(duì)乙酰氨基酚12 mg、鹽酸嗎啉胍12 mg、馬來酸氯苯那敏0.5 mg。甲醇為色譜純或分析純；磷酸、磷酸二氫鉀為分析純；辛烷磺酸鈉（離子對(duì)色譜試劑）；水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Waters XTerraC18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相甲醇（A）-0.02 mol/L磷酸二氫鉀（含0.005 mol/L 辛烷磺酸鈉，10%磷酸調(diào)節(jié)pH 至3.0）（B），梯度洗脫（0～20 min，10%～75% A；20～21 min，75%～10% A；21～26 min，10% A）；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長215 nm；進(jìn)樣量10 μL。色譜圖見圖1。由此可知，各成分分離度良好，理論塔板數(shù)按對(duì)乙酰氨基酚峰計(jì)為18 394，其他成分在三者保留時(shí)間上沒有色譜峰，不干擾測(cè)定。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱取對(duì)照品對(duì)乙酰氨基酚48.38 mg、鹽酸嗎啉胍47.74 mg，置于同一50 mL量瓶中，25%甲醇（pH=3.0）溶解；精密稱取馬來酸氯苯那敏對(duì)照品10.24 mg，置于10 mL 量瓶中，25%甲醇（pH=3）溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取2 mL，置于上述50 mL 量瓶中，溶劑稀釋至刻度，作為貯備液。精密量取5 mL 于10 mL 量瓶中，25%甲醇（pH=3）稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液 取本品10 片，精密稱定質(zhì)量，計(jì)算平均片重，研細(xì)，取約0.22 g（相當(dāng)于12 mg 對(duì)乙酰氨基酚），置于25 mL 量瓶中，25%甲醇（pH=3）超聲助溶，放冷，25%甲醇（pH=3）稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液 按處方比例分別制備不含對(duì)乙酰氨基酚、鹽酸嗎啉胍、馬來酸氯苯那敏的陰性樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.3 定量限 精密稱取對(duì)乙酰氨基酚、鹽酸嗎啉胍、馬來酸氯苯那敏對(duì)照品適量，25%甲醇（pH=3）溶解并分別稀釋成0.32、0.05、0.51 μg/mL，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果，三者信噪比（S/N）分別為37.2、43.8、46.8（以氯苯那敏峰計(jì)）；以S/N=10，得定量限分別為0.09、0.01、0.11 μg/mL。

2.4 線性關(guān)系考察 精密量取對(duì)照品溶液1、2、4、6、8 mL，置于10 mL 量瓶中，25%甲醇（pH=3）稀釋至刻度，搖勻，得線標(biāo)溶液，取其與對(duì)照品溶液共6 份，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，結(jié)果見表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各成分線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.5 精密度試驗(yàn) 精密量取“2.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次，測(cè)得對(duì)乙酰氨基酚、鹽酸嗎啉胍、馬來酸氯苯那敏峰面積RSD 分別為0.2%、0.2%、0.4%，表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批本品（批號(hào)171113），按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得對(duì)乙酰氨基酚、鹽酸嗎啉胍、馬來酸氯苯那敏（以氯苯那敏計(jì)）含有量RSD 分別為1.2%，1.0%、1.3%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密量取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液，室溫下于0、2、4、6、8、12、24 h 在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得對(duì)乙酰氨基酚、鹽酸嗎啉胍、氯苯那敏峰面積RSD 分別為0.4%，0.6%、1.1%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取含有量已知的本品6 份（批號(hào)171113），每份約0.11 g，置于6 個(gè)25 mL 量瓶中；精密稱取對(duì)照品對(duì)乙酰氨基酚60.21 mg、鹽酸嗎啉胍60.02 mg，置同一10 mL 量瓶中，25%甲醇（pH=3）溶解并稀釋至刻度，精密量取1 mL，置于上述25 mL 量瓶中；精密稱取馬來酸氯苯那敏對(duì)照品12.51 mg，置于50 mL 量瓶中，25%甲醇（pH=3）溶解并稀釋至刻度，精密量 取1 mL，置于上 述25 mL 量瓶中，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表2。

表2 各成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab.2 Results of recovery tests for various constituents（n＝6）

2.9 樣品含有量測(cè)定 精密稱取本品3 批，每批3 份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，外標(biāo)法計(jì)算含有量，結(jié)果見表3。

表3 各成分含有量測(cè)定結(jié)果（n＝3）Tab.3 Results of content determination of various constituents（n＝3）

2.10 含有量均勻度測(cè)定 取本品3 批，每批10份，置于25 mL 量瓶中，25%甲醇（pH=3）超聲助溶，放冷，25%甲醇（pH=3）稀釋至刻度，搖勻，各精密量取10 μL，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，外標(biāo)法計(jì)算含有量。然后，根據(jù)2015年版《中國藥典》 四部方法［9］，計(jì)算A［標(biāo)示量（100）與含有量平均值之差的絕對(duì)值］+2.2S（含有量標(biāo)準(zhǔn)差），結(jié)果見表4，發(fā)現(xiàn)均符合藥典規(guī)定［A+2.2S＜L（L以15.0 計(jì)）］。

表4 各成分含有量均勻度測(cè)定結(jié)果Tab.4 Results of content uniformity determination of various constituents

3 討論

3.1 檢測(cè)波長選擇 馬來酸氯苯那敏最大吸收波長為262 nm，但供試品溶液中其質(zhì)量濃度較低，故考慮215 nm，同時(shí)在該處對(duì)乙酰氨基酚有波谷，鹽酸嗎啉胍有波峰。最終，確定215 nm 作為檢測(cè)波長［10］。

3.2 流動(dòng)相選擇

3.2.1 離子對(duì)試劑種類與濃度 本實(shí)驗(yàn)考察了戊烷磺酸鈉、己烷磺酸鈉、庚烷磺酸鈉、辛烷磺酸鈉，發(fā)現(xiàn)離子對(duì)試劑烷基鏈越長，鹽酸嗎啉胍保留時(shí)間越長，與相鄰的對(duì)乙酰氨基酚色譜峰分離度越高［11-12］，而且其濃度對(duì)色譜峰保留也有很大影響［13］，故又對(duì)此進(jìn)行考察。結(jié)果顯示，隨著離子對(duì)試劑濃度的升高，鹽酸嗎啉胍峰保留時(shí)間延長，峰型由不對(duì)稱逐漸優(yōu)化為對(duì)稱，當(dāng)辛烷磺酸鈉濃度高于0.005 mol/L 時(shí)，分離度合適，峰形良好。同時(shí)，考慮到離子對(duì)試劑濃度過大時(shí)對(duì)儀器和色譜柱均有不利影響，故最終選擇0.005 mol/L 辛烷磺酸鈉，可使鹽酸嗎啉胍在色譜柱上有較好的保留，并與其他成分的分離度理想，互不干擾。

3.2.2 緩沖液 本實(shí)驗(yàn)考察了緩沖鹽對(duì)成分分析的影響，發(fā)現(xiàn)基線在無磷酸鹽的流動(dòng)相中不平穩(wěn)，峰形不對(duì)稱；添加磷酸二氫鉀后基線平穩(wěn)，而且由于離子強(qiáng)度的改變，鹽酸嗎啉胍色譜峰保留時(shí)間提前，故選擇0.02 mol/L 磷酸二氫鉀作為緩沖液。

3.2.3 流動(dòng)相pH 本實(shí)驗(yàn)考察了2.0、3.0、4.0、4.5，發(fā)現(xiàn)隨著pH 降低鹽酸嗎啉胍保留時(shí)間延長，同時(shí)峰形高而尖銳，考慮到C18色譜柱對(duì)pH 值的耐受范圍為2～8，故最終選擇3.0 作為流動(dòng)相pH。

3.3 柱溫選擇 柱溫對(duì)離子對(duì)色譜的影響較大［14］。本實(shí)驗(yàn)考察了20、25、30、35、40 ℃，發(fā)現(xiàn)柱溫越高，各組分出峰越快，但過高時(shí)氯苯那敏色譜峰受干擾較大，峰形較差。最終，選擇30 ℃作為柱溫，此時(shí)出峰時(shí)間適中，峰形理想。