呂麗麗 張琳琳 曹宇峰 王磊 邊月平

1 資料與方法

1.1 一般資料 將2016年1月至2018年6月我院收治的90例再生障礙性貧血患者納入研究范圍，按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為對(duì)照組和治療組，每組45例。對(duì)照組男25例，女20例；年齡32～61歲，平均(39.12±5.42)歲；病程1～12年，平均(5.12±0.73)年；中醫(yī)癥候分型：脾腎陰虛型10例，脾腎陽(yáng)虛型19例，脾腎陰陽(yáng)兩虛型16例；治療組男23例，女22例；年齡30～65歲，平均(40.00±5.51)歲；病程1～14年，平均(5.78±0.82)年；中醫(yī)證候分型：脾腎陰虛型12例，脾腎陽(yáng)虛型18例，脾腎陰陽(yáng)兩虛型15例。2組年齡、性別比、病程、中醫(yī)證候分型等一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 2組一般資料比較 n=45

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》制定的再生障礙性貧血診斷標(biāo)準(zhǔn)，且經(jīng)臨床癥狀體征、血常規(guī)指標(biāo)、骨髓涂片及病理學(xué)檢查確診為AA；(2)符合《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》制定的中醫(yī)辨證分型診斷標(biāo)準(zhǔn)；(3)入組前2周內(nèi)未接受過(guò)激素、化療藥物治療者；(4)患者均自愿參加本研究，且簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并PNH、白血病等其他血液系統(tǒng)疾??；(2)合并心﹑肝﹑肺﹑腎等重要臟器功能不全者；(3)妊娠或哺乳期女性；(4)對(duì)本研究藥物過(guò)敏或有禁忌癥者。

1.3 治療方法 對(duì)照組給予環(huán)孢素A(杭州中美華東制藥有限公司)治療，口服，4 mg·kg-1·d-1，2次/d；同時(shí)根據(jù)病情給予抗感染、補(bǔ)血及止血藥物。治療組給予健脾補(bǔ)腎方治療，組成：黃芪24 g，女貞子15 g，太子參24 g，白術(shù)芍15 g，炒丹皮15 g，制半夏10 g，小薊草15 g，菟絲子24 g，炒枳殼10 g，炙甘草6 g。1個(gè)月為1個(gè)療程，共治療2個(gè)療程。針對(duì)不同中醫(yī)辨證分型，健脾補(bǔ)腎方中分別配伍不同中藥，脾腎陰虛型可選擇滋陰生精的藥物，如生地黃、黃柏等；脾腎陽(yáng)虛型可選擇填精助陽(yáng)的藥物，如補(bǔ)骨脂、淫羊藿；脾腎陰陽(yáng)兩虛型可選擇陰陽(yáng)雙補(bǔ)的藥物，如杜仲、制首烏等。

1.4 觀察指標(biāo)及方法

1.4.2 BMNC自噬、凋亡相關(guān)基因mRNA表達(dá)：采用Real time-PCR法測(cè)定BMNC LC3-Ⅱ、Bcl-2、caspase-3、PARP mRNA表達(dá)。按照TRizol說(shuō)明書進(jìn)行BMNC總RNA的提取和逆轉(zhuǎn)錄，SYBR Green染料法進(jìn)行目的基因擴(kuò)增，根據(jù)RQ=2-ΔΔCt計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。引物序列由上海生工生物工程有限公司合成。見表2。

表2 Real time-PCR引物序列

1.4.3 BMNC自噬、凋亡相關(guān)基因蛋白表達(dá)：采用Western blot檢測(cè)BMNC LC3-Ⅱ、Bcl-2、caspase-3、PARP蛋白表達(dá)。提取BMNC總蛋白，BCA法定量蛋白，SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入特異性一抗(1∶5 000稀釋)，4℃過(guò)夜，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗兔 IgG(1∶5 000稀釋)，室溫孵育1 h，PBS洗膜3次，以GAPDH為內(nèi)參照基因，ECL反應(yīng)，采用Image-Pro Plus軟件分析目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.2 2組BMNC細(xì)胞凋亡率比較 治療前2組BMNC細(xì)胞凋亡率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。治療后2組BMNC細(xì)胞凋亡率均明顯低于治療前，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且治療組凋亡率低于對(duì)照組(P<0.05)。見表4。

組別CD+34Fas對(duì)照組 治療前0.31±0.0445.16±5.89 治療后0.48±0.06?30.32±3.67?治療組 治療前0.33±0.0543.87±6.46 治療后0.65±0.09?#17.36±2.50?#

注：與治療前比較，*P<0.05；與對(duì)照組比較，#P<0.05

組別凋亡率對(duì)照組 治療前7.25±0.87 治療后4.90±0.65?治療組 治療前7.29±0.96 治療后2.12±0.33?#

注：與治療前比較，*P<0.05；與對(duì)照組比較，#P<0.05

2.3 2組BMNC自噬相關(guān)基因表達(dá)比較 治療前2組BMNC LC3-Ⅱ mRNA和蛋白表達(dá)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。治療后2組BMNC LC3-Ⅱ mRNA和蛋白表達(dá)均明顯高于治療前，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且治療組LC3-Ⅱ mRNA和蛋白表達(dá)高于對(duì)照組(P<0.05)。見表5。

組別LC3-Ⅱ mRNALC3-Ⅱ蛋白 對(duì)照組 治療前0.34±0.050.30±0.04 治療后0.55±0.08?0.49±0.07?治療組 治療前0.32±0.040.29±0.05 治療后0.87±0.10?#0.80±0.11?#

注：與治療前比較，*P<0.05；與對(duì)照組比較，#P<0.05

2.4 2組BMNC凋亡相關(guān)基因表達(dá)比較 治療前2組BMNC Bcl-2、caspase-3、PARP mRNA和蛋白表達(dá)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。治療后2組BMNCBcl-2 mRNA和蛋白表達(dá)均明顯高于治療前，caspase-3、PARP mRNA和蛋白表達(dá)均明顯低于治療前，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且治療組Bcl-2 mRNA和蛋白表達(dá)高于對(duì)照組，caspase-3、PARP mRNA和蛋白表達(dá)低于對(duì)照組(P<0.05)。見表6。

組別Bcl-2mRNA蛋白caspase-3mRNA蛋白PARPmRNA蛋白對(duì)照組 治療前0.42±0.060.37±0.051.02±0.150.98±0.120.95±0.120.89±0.10 治療后0.63±0.09?0.60±0.08?0.79±0.11?0.72±0.09?0.67±0.11?0.60±0.09?治療組 治療前0.40±0.050.34±0.040.99±0.120.95±0.130.97±0.130.91±0.12 治療后0.99±0.12?#0.90±0.10?#0.40±0.06?#0.35±0.05?#0.38±0.07?#0.31±0.04?#

注：與治療前比較，*P<0.05；與對(duì)照組比較，#P<0.05

3 討論

自噬是真核細(xì)胞內(nèi)自噬溶酶體介導(dǎo)的大分子物質(zhì)降解為氨基酸等基礎(chǔ)物質(zhì)的過(guò)程，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育、分化、凋亡等發(fā)揮重要調(diào)控作用[11]。自噬異常時(shí)細(xì)胞內(nèi)代謝紊亂從而引發(fā)腫瘤、心血管、自身免疫等多種急慢性疾病發(fā)生。越來(lái)越多的證據(jù)表明自噬參與調(diào)控骨髓造血過(guò)程，自噬異常與AA等多種惡性血液系統(tǒng)疾病密切相關(guān)，自噬水平變化在AA發(fā)生發(fā)展中的作用已經(jīng)成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)[12-14]。自噬作用的激活往往伴隨著LC3-Ⅱ表達(dá)升高，該因子在調(diào)控自噬體形成及成熟中發(fā)揮重要作用，可作為反映細(xì)胞自噬程度的可靠指標(biāo)。臨床研究表明，AA患者造血干(祖)細(xì)胞LC3-Ⅱ表達(dá)較健康人顯著降低，且與疾病嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)，經(jīng)免疫抑制劑治療后LC3-Ⅱ表達(dá)有所恢復(fù)，說(shuō)明AA患者存在自噬缺陷，這可能是導(dǎo)致造血干(祖)細(xì)胞凋亡的重要原因[15]。但是，自噬缺陷在AA發(fā)病機(jī)制中的作用尚不清楚。基礎(chǔ)研究表明，敲除小鼠造血干細(xì)胞自噬基因后不僅不能夠維持細(xì)胞靜息狀態(tài)，還會(huì)影響其自我更新，同時(shí)導(dǎo)致細(xì)胞過(guò)度增殖分化。體外實(shí)驗(yàn)表明，自噬基因敲除后造血干細(xì)胞集落形成能力顯著降低[16]。此外，造血微環(huán)境作為骨髓造血干細(xì)胞增殖分化的場(chǎng)所，參與調(diào)控造血干細(xì)胞的自我更新及定向分化，造血微環(huán)境的破壞會(huì)影響造血干細(xì)胞的分化增殖能力，從而導(dǎo)致AA發(fā)生[17]。研究發(fā)現(xiàn)，AA患者骨髓腔脂肪細(xì)胞數(shù)量顯著增加，造血干細(xì)胞數(shù)量減少，導(dǎo)致造血微環(huán)境損傷，這是AA發(fā)生發(fā)展的重要原因[18,19]。而采用自噬激活劑雷帕霉素通過(guò)上調(diào)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞自噬水平降低其成脂性和脂肪細(xì)胞數(shù)量，改善骨髓造血微環(huán)境，這有利于造血干細(xì)胞增殖分化。近年來(lái)，隨著免疫抑制劑在AA臨床治療中的廣泛應(yīng)用，免疫紊亂導(dǎo)致的造血組織損傷是AA發(fā)生發(fā)展的重要病理機(jī)制，而自噬在維持免疫穩(wěn)態(tài)中的作用也越來(lái)越受到重視，自噬異常通過(guò)破壞免疫平衡導(dǎo)致AA等自身免疫性疾病發(fā)生。Pileston等[20]研究發(fā)現(xiàn)敲除小鼠自噬基因后將會(huì)破壞Th1/Th2細(xì)胞平衡，從而導(dǎo)致免疫紊亂。以上研究表明，自噬通過(guò)調(diào)控造血干細(xì)胞增殖分化、靜息態(tài)維持、免疫功能等多種機(jī)制導(dǎo)致AA等免疫相關(guān)疾病發(fā)生發(fā)展。但健脾補(bǔ)腎方是否通過(guò)調(diào)控自噬活性發(fā)揮治療作用尚不明確。本研究通過(guò)Real time-PCR和Western blot檢測(cè)AA患者BMNC自噬、凋亡相關(guān)基因表達(dá)變化，結(jié)果顯示，治療后2組BMNC LC3-Ⅱ、Bcl-2 mRNA和蛋白表達(dá)均明顯高于治療前，caspase-3、PARP mRNA和蛋白表達(dá)均明顯低于治療前，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且治療組Bcl-2 mRNA和蛋白表達(dá)高于對(duì)照組，caspase-3、PARP mRNA和蛋白表達(dá)低于對(duì)照組(P<0.05)。說(shuō)明自噬缺陷和細(xì)胞凋亡在AA發(fā)病中發(fā)揮一定作用，健脾補(bǔ)腎方能夠通過(guò)上調(diào)自噬標(biāo)志性基因表達(dá)，下調(diào)凋亡基因表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞自噬并抑制其凋亡，這可能是其發(fā)揮治療作用的分子機(jī)制之一。