肖蓓 鄧小婧

肺癌是一種全球范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤，分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌。其死亡率較高，且呈現(xiàn)連年上升趨勢，85%～90%的肺癌類型為非小細胞肺癌[1]。因取樣困難等因素的限制使得早期肺癌難以被發(fā)現(xiàn)。大部分肺癌發(fā)現(xiàn)時，癌細胞已發(fā)生轉(zhuǎn)移，因此導(dǎo)致肺癌患者死亡的主要原因是肺癌細胞轉(zhuǎn)移[2]。因此，弄清楚肺癌細胞的擴散機制對于診斷、治療肺癌及其預(yù)后均有顯著的臨床意義。去泛素化酶3(ubiquitin-specific protease 3,USP3)于1999年被發(fā)現(xiàn)[3]，能夠促進正常細胞的凋亡，在癌細胞增殖過程中起著重要調(diào)節(jié)作用[4]：在肝癌細胞中檢測到較高表達量的USP3蛋白[5]；敲低人骨肉瘤細胞U2OS中USP3表達時，細胞增殖受到顯著抑制[6]。目前尚不清楚肺癌組織中USP3的表達水平以及其對于肺癌細胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、遷移和侵襲的影響。為此，本實驗檢測肺癌組織中的USP3的轉(zhuǎn)錄和表達水平，并分析其對A549細胞的皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、遷移和侵襲的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年7月至2019年2月于我院確診的87例肺癌患者為研究對象，其中男49例，女38例；年齡(53～74)歲，平均年齡(65.83±1.62)歲；體重55～63 kg，平均(57.43±3.91)kg；病程10～23個月,平均(15.11±3.63)個月?；颊呔鶡o其他嚴重并發(fā)癥。本研究已獲醫(yī)院倫理委員會批準，所有患者及家屬知情并簽署同意書。

1.2 納入與排除標準

1.2.1 納入標準：所有患者符合《腫瘤學(xué)》[7]中肺癌的診斷標準，并且經(jīng)病理組織學(xué)確診。

1.2.2 排除標準：接受過化療的患者；同時患有其他惡性腫瘤的患者；影像學(xué)資料、病歷資料等不完整的患者。

1.3 RT-PCR檢測 患者術(shù)后從肺癌組織和癌旁組織中取0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm組織各1塊。提取所有樣本RNA后，使用全式金公司的TransScript Two-Step RT-PCR SuperMix (AT401-01)試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA。根據(jù)GeneBank中USP3的序列(NR_046342.1)并借助primer 5.0設(shè)計特異性引物(F：5’-TGAATGCCATCCTTCAGTCA-3’； R：5’-CTTGGCTCCTGGTGTGGTAT-3’)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。將上述cDNA作為模板，按照PCR程序進行擴增：95℃,5 min;95℃,30 s;55℃，30 s;72℃,1 min;30個循環(huán)；72℃,10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)核酸凝膠電泳后置于Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng) (SYSTEM GelDoc XR+,1708195) 中成像。使用Image J分析軟件進行灰度值分析，檢測USP3的轉(zhuǎn)錄水平。

1.4 Western blot 檢測 上海撫生實業(yè)有限公司購買A549細胞，加入含有10%胎牛血清的高糖DMEM細胞培養(yǎng)液中，置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。以3.0×105個/孔的密度接種12孔板，培養(yǎng)24 h后，收集細胞，進行SDS-PAGE蛋白凝膠電泳：濃縮膠恒壓80 V， 20 min；分離膠恒壓120 V，電泳至溴酚藍到凝膠底部。使用Bio-Rad半干轉(zhuǎn)印槽(Trans-Blot SD,170-3940)在恒壓15 V，30 min條件下轉(zhuǎn)印至PVDV膜(生工，F(xiàn)019532-0010)。取下PVDF膜放入封閉液(TBST，5%脫脂奶粉，pH值7.4)中室溫孵育2 h；使用sigma公司生產(chǎn)的USP3一抗稀釋液 (SAB1410046，1∶5 000) 室溫孵育PVDF膜1 h；TBST洗膜3次，每次10 min；使用全式金公司生產(chǎn)的HRP標記的二抗羊抗鼠IgG 稀釋液 (HS201-01,1∶10 000) 室溫孵育PVDF膜1 h；TBST洗膜3次，每次10 min；最后根據(jù)ECL化學(xué)發(fā)光液(上海天能)使用說明，將PVDF膜置于Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)中顯影。實驗重復(fù)3次。采用上述方法，利用E-cadherin抗體(GeneTex,GTX100443)及Vimentin抗體(GeneTex,GTX112661)檢測3組細胞中的做表格計算F值和P值的表達水平。

1.5 RNA干擾 針對USP3的序列(613-635，AGCTACAGTACATACTGTTATCG)，利用在線工具siDirect version 2.0(http://sidirect2.rnai.jp/)設(shè)計并合成小干擾RNA(Small interfering RNA；siRNA):5’-AUAACAGUAUGUACUGUAGCU-3’及5’-CUACAGUACAUACUGUUAUCG-3’。以及陰性對照siRNA：5’-UACUUAUAACGUAGCAGUAUG-3’及5’-AUGAAUAUUGCAUCGUCAUAC-3’。將A549細胞分為3組，其中轉(zhuǎn)染陽性siRNA的為siRNA-USP3組；轉(zhuǎn)染陰性siRNA的為siRNA-control組；不做處理的為對照組。轉(zhuǎn)染6 h 后更換培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，利用Western blot方法檢測3組細胞中的USP3的表達水平。實驗重復(fù)3次。

1.6 細胞劃痕實驗 將3組A549細胞接種到6孔板中(6×105)，分別轉(zhuǎn)染PBS、siRNA-control以及siRNA-USP3。24 h后，用20 μl槍頭垂直于孔底劃痕。用PBS清洗3次，換新鮮的細胞培養(yǎng)液，放入37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在0 h沿劃痕邊緣等間距取三處測量劃痕寬度的平均值，48 h后在相同位置測量寬度。按照下列公式計算愈合率：愈合率(%)=(0 h寬度-48 h寬度)/0 h寬度×100%。

1.7 Transwell小室實驗 肺癌細胞轉(zhuǎn)染 siRNA 24 h后，消化細胞于無血清培養(yǎng)基。將2.5×104個細胞加入鋪有基質(zhì)膠的24孔Transwell小室的上室，下室中加入600 μl含10%胎牛血清的培養(yǎng)基。于 37℃， 5% CO2條件下培養(yǎng)。24 h后取出Transwell小室，用棉簽擦掉基質(zhì)膠及上室未穿膜細胞。甲醇固定10 min，0.2%結(jié)晶紫染色40 min，100倍鏡下隨機選取5個視野計數(shù)穿膜細胞數(shù)目，取平均值。每組實驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 USP3在肺癌組織和癌旁組織中的表達水平比較 RT-PCR及Western blot顯示，USP3在肺癌組織中的轉(zhuǎn)錄及表達水平顯著高于癌旁組織(P<0.05)。見表1，圖1。

組別USP3(轉(zhuǎn)錄)USP3(表達)癌旁組織0.27±0.060.20±0.04肺癌組織0.95±0.190.89±0.18t值31.83034.900P值0.0000.000

圖1 USP3在肺癌組織和癌旁組織中的轉(zhuǎn)錄(A)和表達(B)水平

2.2 RNA干擾效果檢測 3組細胞中USP3的表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。其中，對照組和siRNA-control組中USP3的表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；siRNA-USP3組中USP3的表達量顯著低于其他2組(P<0.05)。表明siRNA-USP3組細胞中USP3蛋白表達被抑制。見表2，圖2。

組別USP3對照組 1.20±0.24siRNA-control組1.12±0.22siRNA-USP3組 0.22±0.04?#F值41.280P值0.000

注：與對照組比較，*P<0.05；與siRNA-control組比較，#P<0.05

圖2 USP3敲低效果檢測

2.3 敲低USP3對肺癌細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響 3組細胞中E-cadherin和Vimentin的表達均存在顯著差異(P<0.05)。其中，對照組和siRNA-control組中E-cadherin和Vimentin的表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；siRNA-USP3組中E-cadherin的表達量顯著高于其他2組(P<0.05)；siRNA-USP3組中Vimentin的表達量顯著低于其他2組(P<0.05)。見表3，圖3。

組別E-cadherinVimentin對照組 0.55±0.111.21±0.24siRNA-control組0.52±0.101.17±0.23siRNA-USP3組 1.16±0.23?#0.65±0.13?#F值26.09011.490P值0.0000.002

注：與對照組比較，*P<0.05；與siRNA-control組比較，#P<0.05

圖3 敲低USP3對肺癌細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響

2.4 敲低USP3對肺癌細胞遷移的影響 3組細胞愈合率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。其中，對照組和siRNA-control組中愈合率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；siRNA-USP3組中愈合率顯著低于其他2組(P<0.05)。見表4，圖4。

組別0 h(mm)48 h(mm)愈合率(%)對照組 10.01±2.003.24±0.6567.62±13.52siRNA-control組10.02±2.003.18±0.6468.28±13.66siRNA-USP3組9.98±1.997.57±1.51?#24.16±4.83?#F值0.00130.54024.420P值0.9990.0000.000

注：與對照組比較，*P<0.05；與siRNA-control組比較，#P<0.05

圖4 敲低USP3對肺癌細胞遷移的影響

2.5 敲低USP3對肺癌細胞侵襲的影響 3組細胞的計數(shù)值差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。其中，對照組和siRNA-control組中細胞數(shù)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；siRNA-USP3組中細胞數(shù)量顯著低于其他2組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表5，圖5。

表5 敲低USP3對肺癌細胞侵襲的影響 個,

注：與對照組比較，*P<0.05；與siRNA-control組比較，#P<0.05

圖5 敲低USP3對肺癌細胞侵襲的影響

3 討論

肺癌造成高死亡率的主要原因在于癌細胞轉(zhuǎn)移。有統(tǒng)計顯示，癌細胞在20%首次確診的小細胞肺癌患者體內(nèi)已發(fā)生腦轉(zhuǎn)移，死亡患者中發(fā)現(xiàn)的腦轉(zhuǎn)移率可高至80%[8]。因此，研究肺癌的轉(zhuǎn)移機制具有重要意義。

雖然早在1999年就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)USP3蛋白，但關(guān)于其功能研究相對較少。有研究表明，USP3在細胞癌變中發(fā)揮了重要作用[9]，肝癌組織和肝癌細胞中USP3的表達水平較高[5]。此外，F(xiàn)ang等[10]發(fā)現(xiàn)，胃部癌變時，也檢測到USP3過表達。Wang等[11]發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌細胞HCT116、LoVo等的轉(zhuǎn)移與USP3過表達有密切關(guān)系。我們的實驗結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，USP3在肺癌組織中的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達量顯著高于癌旁組織組織。為探討USP3的異常表達與肺癌細胞發(fā)生的關(guān)系，我們利用RNA干擾技術(shù)將A549細胞中USP3敲低，與未處理的A549細胞相比，進一步檢測了敲低USP3后，A549細胞的間質(zhì)轉(zhuǎn)化、遷移和侵襲性能的變化情況。

本文設(shè)計合成了USP3的siRNA，對A549細胞轉(zhuǎn)染后發(fā)現(xiàn)，與siRNA-Control組相比較，siRNA-USP3組細胞中USP3蛋白質(zhì)的表達降低，表明siRNA對USP3的抑制效果較好。

劃痕愈合實驗及Transwell試驗結(jié)果顯示，與siRNA-Control組相比較，siRNA-USP3組細胞在培養(yǎng)48 h后，遷移和侵襲細胞數(shù)量降低，表明USP3敲低可以抑制肺癌細胞A549的遷移和侵襲。

癌細胞的轉(zhuǎn)移、侵襲是復(fù)雜的過程，涉及許多因素，最常見的就是EMT。EMT現(xiàn)象存在于腫瘤的所有階段，主要分子特征是上皮細胞標記蛋白E-cadherin表達減少，Vimentin表達增多[12]。腫瘤細胞間遷移和侵襲能力在發(fā)生EMT的時候顯著增強。因此，本實驗同時各組細胞中E-cadherin和Vimentin的表達水平進行檢測。結(jié)果顯示，在USP3表達降低的細胞中，其E-cadherin表達量顯著增加，Vimentin表達量降低，表明USP3敲低可以抑制肺癌細胞A549的間質(zhì)轉(zhuǎn)化。

綜上所述，USP3在肺癌組織中呈現(xiàn)高表達。USP3敲低可以抑制肺癌細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、遷移和侵襲，可將USP3作為肺癌治療的新方向。

本文仍存在不足：(1)樣本量不多，不能更加完整、真實地反應(yīng)臨床狀況，今后的研究中需要采集更多的臨床病例，增加實驗樣本數(shù)量。(2)本次實驗在細胞學(xué)水平初步驗證了USP3的作用，但是無法代表體內(nèi)的真實情況，仍需構(gòu)建肺癌的動物模型，進一步模擬體內(nèi)真實環(huán)境，得出較貼近真實情況的數(shù)據(jù)。(3)本文僅對USP3與肺癌的作用做了初步探索，今后需要挖掘與之有關(guān)的信號通路蛋白，以完善肺癌發(fā)生、發(fā)展機制。