孫永 孫輝 姚凱華 李志鋒 李永文

作為一種常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)又被稱為老年性癡呆，其臨床特征主要表現(xiàn)為進(jìn)行性記憶障礙、認(rèn)知功能障礙、行為失常及人格改變[1-3]。細(xì)胞間淀粉樣斑塊及大量的神經(jīng)原纖維纏結(jié)是該病的主要病理學(xué)特征[4]。環(huán)境、遺傳等被認(rèn)為是導(dǎo)致發(fā)病的重要因素，淀粉樣級聯(lián)假說認(rèn)為β-淀粉樣蛋白聚集于細(xì)胞外形成纖維狀，進(jìn)一步發(fā)展為老年斑，引起局部組織發(fā)生炎癥甚至導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡，但目前關(guān)于其發(fā)病機(jī)制仍未有明確定論[5,6]。微小RNA(MicroRNA,miRNA)是一類非編碼的可調(diào)控基因表達(dá)的小分子RNA，在血清、乳汁、唾液及尿液等中均被檢測到[7,8]。近年來，諸多研究表明miRNA與腫瘤、神經(jīng)退行性疾病等多種疾病相關(guān)，血清中miRNA的種類和水平可用于反應(yīng)疾病的類型、進(jìn)展及機(jī)體的生理狀況[9,10]。關(guān)于老年性癡呆患者血清中miR-221水平與認(rèn)知功能的關(guān)系尚未見報(bào)道，因此本研究采用淀粉樣蛋白(Aβ1-42)誘導(dǎo)AD大鼠模型，以探討大鼠模型血清中miR-221的表達(dá)水平與認(rèn)知功能的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、細(xì)胞株及主要試劑 8～12周齡SPF 級健康雄性Sprague—Dawley(SD) 大鼠[合格證號：SYXK(京)2013-0032]60只，體重200～300 g/只，于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司采購，將大鼠隨機(jī)分籠，于60%～70%濕度、21℃～26℃室溫下適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，期間讓其自由飲水飲食。Aβl-42購自北京中杉金橋，使用前將其用無菌0.9%氯化鈉溶液稀釋至10 μg/μl，置于37℃作用1周，使其成聚集態(tài)。熒光定量PCR試劑盒及Trizol均購自為TAKARA公司。jet PRIME購自美國polyplus公司。miR-221過表達(dá)慢病毒及miR-221空載體對照由上海吉?jiǎng)P設(shè)計(jì)并構(gòu)建。兔多克隆抗體to BACE1(Anti-BACE1抗體，ab2077)購自Abcam。

1.2 大鼠建模 將60只大鼠隨機(jī)分為Aβ1-42誘導(dǎo)的AD組、AD+miR-221過表達(dá)組、AD+空載體組及正常對照組，每組15只。Aβ1-42誘導(dǎo)的AD方法：采用腹腔注射10% 水合氯醛(30 mg/kg)的方法麻醉大鼠，用腦立體定位儀(日本NARISHIGE型)將大鼠頭部固定，頭頂部去毛，碘伏棉球消毒手術(shù)區(qū)，取顱頂中部作小縱切口使顱骨暴露，首先定位前囟并于其中線處旁開，向后、向下各3.0 mm，用1 mm牙科鉆于顱骨上打兩個(gè)對稱孔，作為海馬區(qū)注射點(diǎn)。將硬腦膜用針挑破，雙側(cè)海馬區(qū)各注射10 μg Aβ1-42，為使溶液充分彌散，注射時(shí)間控制在10 min，之后留針10 min，撤針時(shí)需緩慢。針孔用牙托粉填補(bǔ)，同時(shí)為防止傷口感染可使用慶大霉素，將皮膚縫合并再次消毒。術(shù)后大鼠完全清醒前進(jìn)行單籠飼養(yǎng)。AD+miR-221過表達(dá)組、AD+miR-221空載體組分別于AD大鼠尾靜脈注射miR-221慢病毒質(zhì)粒及空載體質(zhì)粒，正常對照組不進(jìn)行任何處理。

1.3 RT-qPCR檢測4組大鼠血清中miR-221水平 各組大鼠建模完成后1周，采用斷尾采血的方式收集大鼠血液，離心，分離血清，-80℃保存?zhèn)溆?。用Trizol法提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以得到的該cDNA為模板進(jìn)行熒光定量PCR，檢測血清中miR-221的表達(dá)水平。同時(shí)以U6作為內(nèi)參基因。每個(gè)樣本均進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 水迷宮實(shí)驗(yàn) 4組大鼠建模完成后7 d進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)，定位航行實(shí)驗(yàn)訓(xùn)練連續(xù)進(jìn)行4 d，4次/d，分別取不同象限的固定位置作為入水點(diǎn)，保持25～28℃的水溫，將大鼠放入水中時(shí)面向水池壁，大鼠入水到其找到平臺的時(shí)間作為逃避潛伏期。若大鼠入水2 min內(nèi)未找到平臺則輕輕將其拖上平臺休息30 s，若大鼠自行在2 min內(nèi)找到平臺，則讓其在平臺上休息30 s。從4個(gè)入水點(diǎn)將大鼠分別放入水池即為1次訓(xùn)練，計(jì)算機(jī)全程跟蹤各大鼠訓(xùn)練過程，游泳距離取4次總行程的平均值，計(jì)算逃避潛伏期。以第5天的成績平均值作為最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.5 海馬區(qū)和大腦皮質(zhì)神經(jīng)元毒性檢測 大鼠建模完成后存活8周，以腹腔注射10%水合氯醛(0.35 g/kg)的方式將其麻醉，然后依次用0.9%氯化鈉溶液200 ml、含5%戊二醛的1%多聚甲醛400 ml進(jìn)行灌流固定，取出大鼠海馬及大腦皮質(zhì)，冷凍切片后采用丙酮固定，最后經(jīng)常規(guī)HE染色后觀察。

1.6 Western-blot檢測大腦組織中BACE1蛋白 大鼠建模完成后存活8周，取大鼠大腦組織，用動(dòng)物細(xì)胞/組織總蛋白提取試劑盒，提取組織總蛋白，用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量。制備蛋白樣品，并進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜，加含有5%BSA的封閉液室溫下孵育2 h，加入用封閉液稀釋的Anti-BACE1抗體，4℃冰箱過夜孵育。次日取出復(fù)溫后，PBST洗膜3次，每次10 min，再加稀釋好的HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗，室溫孵育1 h，PBST洗膜，加ECL進(jìn)行顯色，暗室曝光拍照，同時(shí)以GAPDH作為內(nèi)參蛋白。

2 結(jié)果

2.1 4組大鼠血清中miR-221的表達(dá)水平 采用RT-qPCR檢測4組大鼠血清中miR-221表達(dá)水平，以U6作為內(nèi)參基因，以正常對照組作為標(biāo)準(zhǔn)，AD組、AD+空載體組及AD+miR-221過表達(dá)組中miR-221水平均顯著低于對照組(P<0.05)，AD+miR-221過表達(dá)組高于AD組、AD+空載體組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1，圖1。

組別miR-221表達(dá)水平正常對照組1.05±0.13AD組0.57±0.08?#AD+空載組0.59±0.09?#AD+過表達(dá)組0.77±0.11?

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與AD+過表達(dá)組比較，#P<0.05

圖1RT-qPCR檢測4組大鼠血清中miR-221表達(dá)水平;與正常對照組比較，*P<0.05；與AD組、AD+空載體組比較，#P<0.05

2.2 4組大鼠的認(rèn)知功能 水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測4組大鼠的認(rèn)知功能，結(jié)果顯示，與正常對照組比較，AD組、AD+空載體組及AD+miR-221過表達(dá)組大鼠逃避潛伏期顯著延長(P<0.05)；AD+miR-221過表達(dá)組與AD組、AD+空載體組比較，大鼠逃避潛伏期明顯縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2，圖2。

組別逃避潛伏期正常對照組10.19±0.89AD組27.38±2.12?#AD+空載組27.51±2.09?#AD+過表達(dá)組14.71±1.91?

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與AD+過表達(dá)組比較，#P<0.05

圖2水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測4組大鼠的認(rèn)知功能;與正常對照組比較，*P<0.05；與AD組、AD+空載體組比較，#P<0.05

2.3 4組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元毒性檢測結(jié)果 HE染色后顯微鏡下觀察，正常對照組大鼠海馬區(qū)CAI區(qū)保持完整結(jié)構(gòu)，神經(jīng)元具有正常形態(tài)，整齊排列并且均勻分布。AD組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元損傷嚴(yán)重，CAI區(qū)錐體細(xì)胞數(shù)量減少，體積變小，排列紊亂，胞質(zhì)呈淡紅色，胞核大量固縮且呈藍(lán)黑色。AD+空載體組與AD組相近。AD+過表達(dá)組相比AD組和AD+空載體組改善顯著。見圖3。

圖3 4組大鼠海馬區(qū)的形態(tài)學(xué)變化(HE染色×400);A 正常對照組;B AD組;C AD+空載體組;D AD+過表達(dá)組

2.4 4組大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元毒性檢測結(jié)果 正常對照組大腦皮質(zhì)神經(jīng)元緊密規(guī)則排列，細(xì)胞核位于細(xì)胞中央，染色淺、大而圓，未見損傷。AD組大腦皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)元大量凋亡，體積變小，胞質(zhì)呈淡紅色，嗜酸性增強(qiáng)，胞核固縮，呈藍(lán)黑色，染色質(zhì)呈團(tuán)塊狀。AD+空載體組與AD組相近。AD+過表達(dá)組與AD組和AD+空載體組比較顯著改善，趨向于正常對照組。見圖4。

2.5 大腦組織中BACE1蛋白表達(dá) Western-blot檢測結(jié)果顯示，與正常對照組比較，AD組和AD+空載體組大腦組織中BACEl蛋白表達(dá)量明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；AD組和AD+空載體組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；AD+過表達(dá)組顯著低于AD組和AD+空載體組(P<0.05)，高于正常對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3，圖5。

圖44組大鼠大腦皮質(zhì)區(qū)的形態(tài)學(xué)變化(HE染色×400);A 正常對照組;B AD組;C AD+空載體組;D AD+過表達(dá)組

組別BACEI/GAPDH正常對照組0.32±0.09AD組0.95±0.19?AD+空載組0.92±0.18?AD+過表達(dá)組0.46±0.12?#

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與AD組、AD+空載體組比較，#P<0.05

圖5Western-blot檢測大鼠大腦組織中BACE1蛋白;與正常對照組比較，*P<0.05;與AD+過表達(dá)組比較，#P<0.05

3 討論

作為老年性癡呆患者腦內(nèi)老年斑的主要成分，含有39～43個(gè)氨基酸多肽的β-淀粉樣蛋白(Aβ)，由淀粉樣前體蛋白(APP)水解產(chǎn)生后又因機(jī)體代謝障礙而于海馬、基底核等部位沉積，可使神經(jīng)纖維纏結(jié)，從而誘導(dǎo)神經(jīng)元產(chǎn)生退行性病變以及學(xué)習(xí)記憶障礙[11-13]，因此Aβ可用于建立AD動(dòng)物模型。微小RNA(microRNA，miRNA)屬于內(nèi)源性非編碼小RNA，約包含21～23個(gè)堿基，其單鏈 RNA 前體約70～90個(gè)堿基且具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)，經(jīng)Dicer 酶加工后生成miRNA[14-16]。miRNA與靶 mRNA 的 3'UTR結(jié)合是通過堿基配對的方式，其翻譯過程受到抑制而轉(zhuǎn)錄不被影響[17]。在細(xì)胞增殖凋亡、干細(xì)胞分化、發(fā)育以及各種疾病等生物學(xué)行為發(fā)生過程中均有靶 mRNAs的參與[18]。miRNA于機(jī)體血漿、血清中穩(wěn)定存在，采用常規(guī)RNA萃取法即可獲得，機(jī)體的生理、疾病狀況等可通過檢測血清樣本中miRNA的種類、數(shù)目來反映，因此對miRNA的研究越來越廣泛[19,20]。最初于斑馬魚中克隆得到的miR-221(hsa-miR-221)，后來依次于人類 HL-60 白血病細(xì)胞、老鼠神經(jīng)元細(xì)胞中得到[21]。其成簇分布，轉(zhuǎn)錄形式為大順反子，且基本上同步表達(dá)，位于X染色體p11.3區(qū)約1 kb區(qū)域內(nèi)[22]。miR-221被證實(shí)在多種腫瘤細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，發(fā)揮促癌基因的作用；此外miR-221被敲除后可抑制小鼠血管平滑肌細(xì)胞增生以及血管內(nèi)膜新生；此外有研究發(fā)現(xiàn)隨著年齡的增長miR-221大量減少，進(jìn)而引起其靶基因 P13K 增加，揭示 miRNA 及其靶基因的變化有望用于診斷人類老齡化疾病[23-26]。

本研究首先采用Aβ1-42誘導(dǎo)AD大鼠模型，然后分別將miR-221過表達(dá)慢病毒質(zhì)粒及空載體質(zhì)粒注射于AD大鼠尾靜脈，同時(shí)設(shè)置不作任何處理的正常對照組。RT-qPCR檢測4組大鼠血清中miR-221表達(dá)水平，結(jié)果顯示正常對照組顯著高于其他3組(P<0.05)，AD+miR-221過表達(dá)組高于AD組、AD+空載體組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。該結(jié)果表明Aβ1-42誘導(dǎo)AD大鼠模型成功，AD大鼠中miR-221表達(dá)水平顯著降低，注射miR-221過表達(dá)慢病毒質(zhì)粒后，miR-221表達(dá)水平升高，與預(yù)期相符。評價(jià)實(shí)驗(yàn)大鼠認(rèn)知水平能力常采用水迷宮實(shí)驗(yàn)，其尋找安全逃生通道的空間認(rèn)知能力以逃避潛伏期來反映，本研究表明經(jīng)Aβ1-42誘導(dǎo)后大鼠逃避潛伏期顯著延長，即認(rèn)知功能顯著下降，AD大鼠體內(nèi)miR-221表達(dá)水平升高后，其逃避潛伏期明顯縮短，認(rèn)知功能得到提高，提示miR-221的表達(dá)與大鼠的認(rèn)知功能呈正相關(guān)。作為大腦邊緣系統(tǒng)的一部分，海馬主要發(fā)揮學(xué)習(xí)與記憶功能，且是老年性癡呆最先遭受損傷的區(qū)域。為了進(jìn)一步驗(yàn)證Aβ1-42誘導(dǎo)的老年性癡呆大鼠miR-221的表達(dá)與認(rèn)知功能的關(guān)系，采用HE染色檢測4組大鼠海馬區(qū)及大腦皮層區(qū)神經(jīng)元的病理變化，結(jié)果表明AD組均嚴(yán)重受損，AD+空載體組與其受損程度相近，AD+過表達(dá)組神經(jīng)元損傷得到顯著改善，且趨向于正常對照組。該結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)Aβ1-42具有神經(jīng)毒性，可損傷大鼠海馬區(qū)及大腦皮質(zhì)神經(jīng)元，導(dǎo)致細(xì)胞死亡進(jìn)而誘發(fā)老年性癡呆，miR-221則可逆轉(zhuǎn)老年性癡呆程度，間接說明miR-221可抑制老年性癡呆的發(fā)生。淀粉樣前體蛋白(APP)作為A β的來源，是一種跨膜糖蛋白，依次在BACE1及γ-分泌酶作用下被裂解為各種長度的Aβ，聚集形成的沉積物即可形成腦內(nèi)老年斑，其中胃蛋白酶家族的BACE1主要于神經(jīng)細(xì)胞中表達(dá)。本研究采用Western-blot檢測BACE1在大腦組織中的表達(dá)，結(jié)果顯示Aβ1-42誘導(dǎo)后老年性癡呆大鼠大腦組織中BACE1蛋白表達(dá)量明顯升高，而miR-221水平的升高抑制了BACE1的表達(dá)。提示BACE1可能是miR-221的靶基因，且miR-221對BACE1的表達(dá)發(fā)揮負(fù)向調(diào)控的作用。

綜上，miR-221可能是通過降低BACE1的表達(dá)水平進(jìn)而抑制Aβ1-42誘導(dǎo)的大鼠老年性癡呆，提高大鼠認(rèn)知功能。今后miR-221有望作為進(jìn)一步研究老年性癡呆臨床檢測及治療的新靶標(biāo)。