閆顏 汪茜 秦寶麗

結(jié)直腸癌是第三常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤。作為第三常見的導(dǎo)致癌癥相關(guān)死亡的疾病，每年約有1 360 000 例新發(fā)的結(jié)直腸癌病例確診，并且每年約有700 000例結(jié)直腸癌患者死亡[1]。盡管隨著結(jié)直腸癌治療的系統(tǒng)化及聯(lián)合抗腫瘤療法的進一步開展，結(jié)直腸的致死率已經(jīng)降低到約35%左右，仍有超過一半或更多的結(jié)直腸癌患者最終死于遠處轉(zhuǎn)移[2]。因此，找到新的與結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的靶分子并明確其作用機制，對分子靶向治療結(jié)直腸癌的開展及新的靶向藥物的開發(fā)都具有極強的理論和實際意義。近年來，越來越多的學(xué)者將關(guān)注的重點放在非編碼RNA(noncoding RNAs，ncRNAs)與腫瘤領(lǐng)域。非編碼RNA是一大類不具有蛋白質(zhì)編碼能力的RNA轉(zhuǎn)錄物。根據(jù)其長度，非編碼RNA被分成長鏈非編碼RNA(long noncoding RNAs，lncRNAs)與微小RNA(microRNAs，miRNAs)[3,4]。長鏈非編碼RNA是指長度超過200個核苷酸的非編碼RNA。長鏈非編碼RNA在結(jié)直腸癌中廣為表達并且與結(jié)直腸癌的多種惡性表型密切相關(guān)。Wang等[5]研究發(fā)現(xiàn)長鏈非編碼RNA DANCR可通過競爭性抑制miR-577的方式促進熱休克蛋白27(heat shock protein 27，HSP27)的表達并促進結(jié)直腸癌細胞增殖及侵襲轉(zhuǎn)移。Wang等[6]報道稱長基因間非編碼RNA 460(long intergenic non-protein coding RNA 460，LINC00460)在結(jié)直腸癌中表達升高，LINC00460能夠促進結(jié)直腸癌細胞系SW620和HCT116細胞的增殖。目前，關(guān)于長基因間非編碼RNA 483(long intergenic non-protein coding RNA 483，LINC00483)在結(jié)直腸癌中表達及其對結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移作用的研究鮮有報道。MiRNAs在腫瘤中的作用同樣是非編碼RNA研究領(lǐng)域的又一熱點話題。miRNAs在包括結(jié)直腸癌在內(nèi)的多種腫瘤中廣為表達且發(fā)揮著多種生物學(xué)作用。Yan等[7]研究發(fā)現(xiàn)微小RNA 495 (microRNA-495，miRNA-495)能夠通過打靶(family with sequence similarity 83 member D，F(xiàn)AM83D)的方式抑制結(jié)直腸癌細胞增殖及侵襲轉(zhuǎn)移。目前關(guān)于微小RNA 204-3p(microRNA-204-3p，miR-204-3p)在結(jié)直腸癌中作用的研究不多。在本研究中，我們初步探討了LINC00483及miR-204-3p在結(jié)直腸癌中表達及其對結(jié)直腸癌細胞系HT29及LOVO細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

1.1.1 組織標本：我們收集了70例2015年1月至2018年6月在遼寧省腫瘤醫(yī)院接受結(jié)直腸癌腫瘤切除術(shù)患者的結(jié)直腸癌組織及配對的癌旁組織標本，其中結(jié)腸癌37例，直腸癌33例。所有患者經(jīng)病理學(xué)檢查證實診斷為結(jié)腸癌和或直腸癌。其中男34例，女36例;年齡51～77歲，平均(63.2±10.4)歲，所有患者術(shù)前均未接受放療或化療。

1.1.2 細胞系：人正常腸上皮細胞系NCM460和人結(jié)腸癌細胞系HT29及LOVO購自中科院上海細胞庫。

1.1.3 主要試劑：RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自美國Gibco公司；青霉素、鏈霉素購于上海寶曼生物科技有限公司；TRIzol及Lipofectamine2000購自美國Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時熒光定量PCR試劑盒購于德國Roche公司；Transwell小室購自美國Corning公司；特異性LINC00483干擾寡核苷酸(siLINC00483)及錯義對照寡核苷酸(siscramble，siSCR)，miR-204-3p抑制物(miR-204-3p inhibitor)及抑制物對照(negative control inhibitor， NC inhibitor)均由廣州銳博生物科技有限公司設(shè)計合成；引物由上海生工生物工程公司合成。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng):人正常腸上皮細胞株NCM460及人結(jié)腸癌細胞株HT29和LOVO均接種于RPMI1640培養(yǎng)基并添加10% FBS、100 U/ml青霉素和100 mg/ml鏈霉素，并置于37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞融合率達80%時，以0.25%胰蛋白酶消化并傳代。

1.2.2 細胞轉(zhuǎn)染:取生長狀態(tài)佳的HT29和LOVO細胞調(diào)整密度為2×105個細胞/孔接種于6孔板中，24 h后，利用Lipofectamine2000將siSCR及siLINC004

83、NC inhibitor及miR-204-3p inhibitor分別轉(zhuǎn)染和或共轉(zhuǎn)染至HT29和LOVO細胞中，具體操作嚴格按照轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進行。48 h后進行后續(xù)實驗。

1.2.3 實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng):(reverse transcription and quantitative PCR，qRT-PCR) LINC00483及miR-204-3p的表達均采用qRT-PCR的方法進行。參照Trizol說明書提取組織及細胞的總RNA并分組標記。取5 μg總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)以合成cDNA，反應(yīng)產(chǎn)物按實時熒光定量PCR試劑盒說明書進行PCR擴增，設(shè)定GAPDH作為內(nèi)參，具體反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性15 s；95℃變性5 s，60℃退火延伸30 s，共45個循環(huán)。見表1。

表1 引物序列表

1.2.4 Transwell實驗:采用文獻報道的方法[8]進行Transwell實驗檢測HT29及LOVO細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力，具體操作主要參照Transwell小室說明書進行。簡要描述如下：常規(guī)包被底部膜，水化。將不同轉(zhuǎn)染處理48 h的HT29和LOVO細胞接種于Transwell上室內(nèi)，接種密度為5×104個/孔。在上室內(nèi)加入100 μl含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，下室內(nèi)加入500 μl含20%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，并置于37℃、5% CO2的孵箱中孵育。48 h后取出Transwell小室，棉簽拭去Transwell小室內(nèi)部細胞，沖洗、固定、染色后倒置顯微鏡下觀察并計數(shù)穿膜細胞數(shù)。每組鋪6個Transwell小室，取其平均值。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌中長鏈非編碼RNA LINC00483的表達升高而miR-204-3p表達降低 qRT-PCR檢測結(jié)果提示，相比于癌旁組織，LINC00483在絕大部分(65/70，92.86%)結(jié)直腸癌組織標本中表達增高。qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，miR-204-3p在大部分結(jié)直腸癌組織標本中表達降低，相比于正常腸上皮細胞系NCM460，結(jié)直腸癌細胞系HT29及LOVO中的LINC00483表達增高而miR-204-3p表達降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1，表2。

圖1 LINC00483及miR-204-3p在結(jié)直腸癌組織及細胞系中的表達

類別LINC00483miR-204-3pNCM4601.00±0.101.10±0.13HT29 7.36±0.42?0.23±0.06?LOVO 6.87±0.48?0.25±0.06?F值414.60257.80P值<0.0001<0.0001

注：與NCM460組比較，*P<0.01

2.2 長鏈非編碼RNA LINC00483及微小RNA miR-204-3p的表達與結(jié)直腸癌患者不良病理參數(shù)密切相關(guān) 分別根據(jù)LINC00483及miR-204-3p在本研究所收集的70例樣本中相對表達的中位值，我們將這70例患者分別分成LINC00483高表達組與LINC00483低表達組以及miR-204-3p高表達組與miR-204-3p低表達組。高表達的LINC00483和低表達的miR-204-3p均與結(jié)直腸癌的更高的臨床分期(P=0.027和P=0.000)、更高的TNM分期(P=0.001和P=0.008)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.015和P=0.004)和遠處轉(zhuǎn)移(P=0.004和P=0.001)密切相關(guān)。見表3。

表3 結(jié)直腸癌中LINC00483和 miR-204-3p 的表達與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性分析 例

2.3 下調(diào)LINC00483可促進結(jié)直腸癌細胞HT29及LOVO中miR-204-3p的表達并抑制其遷移 在HT29及LOVO細胞中分別轉(zhuǎn)染LINC00483 siRNA(siLINC00483)及相應(yīng)的錯義對照寡核苷酸(siSCR)并通過qRT-PCR確認。相比于轉(zhuǎn)染siSCR組，轉(zhuǎn)染siLINC00483后HT29及LOVO細胞內(nèi)LINC00483的表達明顯降低(P<0.01)，即證實轉(zhuǎn)染獲得了成功。轉(zhuǎn)染siLINC00483也就是下調(diào)LINC00483后，miR-204-3p的表達明顯增高(P<0.01)。相比于siSCR組，轉(zhuǎn)染siLINC00483也就是下調(diào)LINC00483后，HT29及LOVO細胞的遷移能力明顯降低(P<0.01)。見圖2，表4、5。

圖2下調(diào)LINC00483可抑制HT29及LOVO細胞的遷移能力(結(jié)晶紫染色×40)

2.4 下調(diào)miR-204-3p的表達可部分逆轉(zhuǎn)LINC00483 siRNA對HT29和LOVO細胞遷移的抑制作用 我們將LINC00483 siRNA與miR-204-3p inhibitor進行了共轉(zhuǎn)染，LINC00483 siRNA對miR-204-3p表達的促進作用明顯被miR-204-3p所削弱(P<0.01)。相比于共轉(zhuǎn)染LINC00483 siRNA + NC inhibitor組，共轉(zhuǎn)染LINC00483 siRNA + miR-204-3p inhibitor組的HT29和LOVO細胞的侵襲能力明顯得到了部分增強(P<0.01)，即下調(diào)miR-204-3p的表達可部分逆轉(zhuǎn)LINC00483 siRNA對HT29和LOVO細胞遷移的抑制作用。見圖3，表6、7。

類別LINC00483HT29LOVOmiR-204-3pHT29LOVOsiSCR 1.00±0.921.00±0.851.00±0.881.00±0.79siLINC004830.33±0.04?0.42±0.07?9.85±0.05?1.16±0.12?P值<0.0001<0.0001<0.0001<0.0001

注：與siSCR組比較，*P<0.01

類別HT29LOVOsiSCR 1.00±0.141.10±0.11siLINC004830.48±0.050.37±0.06P值<0.0001<0.0001

圖3 下調(diào)miR-204-3p的表達可部分逆轉(zhuǎn)LINC00483 siRNA對HT29和LOVO細胞遷移的抑制作用(結(jié)晶紫染色×40)

類別HT29LOVOsiSCR1.00±0.111.10±0.09siLINC004839.44±0.419.25±0.46siLINC00483+NC inhibitor9.31±0.569.37±0.47siLINC00483+miR-204-3p inhibitor0.33±0.060.32±0.04 F值631.60698.30 P值<0.0001<0.0001

類別HT29LOVOsiSCR1.00±0.111.10±0.09siLINC004830.36±0.060.44±0.06siLINC00483+NC inhibitor0.33±0.050.43±0.05siLINC00483+miR-204-3p inhibitor1.74±0.221.68±0.14 F值102.50158.90 P值<0.0001<0.0001

3 討論

作為非編碼RNA(noncoding RNAs)家族中的重要組成成員，lncRNAs指的是一大類長度超過200個堿基的長鏈大分子RNA轉(zhuǎn)錄物[9]。長鏈非編碼RNA作用機制極為復(fù)雜，包括作為支架或向?qū)д{(diào)控蛋白與基因的相互作用，通過“海綿”的方式與微小RNA(microRNA，miRNA)相結(jié)合，作為增強子調(diào)控其下游靶基因的轉(zhuǎn)錄等等[10,11]。長鏈非編碼RNA廣泛參與到包括腫瘤細胞的增殖、凋亡、侵襲轉(zhuǎn)移等多個生物學(xué)行為過程[3,12]。

作為一種新的長鏈非編碼RNA，長基因間非編碼RNA 483(long intergenic non-protein coding RNA 483，LINC00483)全長含有825個堿基，其在人染色體的位置是17q21.33。Li等[13]發(fā)現(xiàn)LINC00483在胃癌中表達增高并與胃癌患者的不良預(yù)后密切相關(guān)，LINC00483可通過與miR-30a-3p相結(jié)合并且以競爭性內(nèi)源性RNA的方式促進精子相關(guān)抗原9(sperm associated antigen 9，SPAG9)的表達從而提高胃癌細胞系BGC823的增殖及侵襲轉(zhuǎn)移能力。在本研究中，關(guān)注了LINC00483在結(jié)直腸癌中的表達情況，發(fā)現(xiàn)LINC00483在絕大部分結(jié)直腸癌組織中表達增高，進一步的細胞學(xué)檢測同樣證實其在在結(jié)直腸癌細胞系HT29及LOVO中表達明顯高于正常腸上皮細胞系NCM460，提示其在結(jié)直腸癌中可能發(fā)揮著癌基因的角色。通過進一步的Pearson卡方分析，發(fā)現(xiàn)，高表達的LINC00483與結(jié)直腸癌患者的更高的臨床分期、更高的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，提示LINC00483可能參與結(jié)直腸癌的進展及侵襲轉(zhuǎn)移。為了證實我們的設(shè)想，我們通過構(gòu)建的功能缺失實驗考察了不同表達水平的LINC00483 對結(jié)直腸癌遷移能力的影響。發(fā)現(xiàn)下調(diào)LINC00483后結(jié)直腸癌細胞系HT29和LOVO的遷移能力明顯降低。同時，我們發(fā)現(xiàn)，下調(diào)LINC00483可明顯提高HT29和LOVO細胞內(nèi)miR-204-3p的表達。

人miR-204-3p位于人染色體9q21.12，全長僅有21個堿基。MiR-204-3p在多種惡性腫瘤中都扮演著抑癌基因的作用。Chen PH研究發(fā)現(xiàn)，miR-204-3p可促進黃腐酚誘導(dǎo)的膠質(zhì)瘤細胞凋亡[14]。Li等[15]報道稱，長鏈非編碼RNA BRM可通過吸附miR-204-3p的方式上調(diào)翻譯調(diào)節(jié)腫瘤蛋白1(tumor protein,translationally- controlled 1，TPT1)的表達并促進結(jié)直腸癌細胞增殖及侵襲轉(zhuǎn)移。本研究中，首先考察了miR-204-3p在結(jié)直腸癌組織及細胞系中的表達情況。與Li等[15]的研究結(jié)果相類似，我們同樣發(fā)現(xiàn)miR-204-3p在結(jié)直腸癌組織及細胞系中表達降低。此外，通過Pearson卡方檢驗發(fā)現(xiàn)，低表達的miR-204-3p也與結(jié)直腸癌患者的更高的臨床分期、更高的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。結(jié)合前部分的LINC00483的檢測結(jié)果，我們推斷兩者可能協(xié)同參與到結(jié)直腸癌的進展及侵襲轉(zhuǎn)移過程中。我們檢測了不同LINC00483表達水平對miR-204-3p表達的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當我們下調(diào)LINC00483后，miR-204-3p的表達明顯上調(diào)。進一步，我們通過功能學(xué)實驗驗證miR-204-3p在LINC00483介導(dǎo)的結(jié)直腸癌細胞系HT29及LOVO遷移中的作用。我們發(fā)現(xiàn)，下調(diào)LINC00483可明顯抑制HT29及LOVO細胞遷移，而當我們在這個構(gòu)建的LINC00483敲低表達的細胞模型中進一步沉默miR-204-3p的表達后，HT29及LOVO細胞的遷移能力復(fù)又增高。以上研究提示，miR-204-3p是LINC00483下游的重要靶基因，兩者均參與到結(jié)直腸癌細胞的遷移過程。

腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移是一個極為復(fù)雜的涉及到多因子多通路的細胞學(xué)過程。同大多數(shù)惡性腫瘤一樣，結(jié)直腸癌的侵襲轉(zhuǎn)移同樣是多個分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)協(xié)同作用的結(jié)果。我們的研究僅僅揭示了LINC00483/miR-204-3p軸在結(jié)直腸癌遷移過程中的作用。長鏈非編碼RNA及微小RNA下游的靶基因眾多，我們會在進一步研究中深入探討這兩個分子的具體作用機制并找尋其協(xié)同作用的靶分子，為分子水平治療結(jié)直腸癌的開展提供新視野。