楊歌 趙毅 韓詩(shī)邈 朱超 黃淵余 屈鋒

摘?要?核酸適配體是通過(guò)指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化（SELEX）技術(shù)，在體外篩選獲得的與目標(biāo)分子有高親和力與特異性的寡核苷酸序列。由于篩選過(guò)程周期長(zhǎng)且影響因素復(fù)雜，使用常規(guī)篩選方法進(jìn)行多因素影響的條件優(yōu)化的工作量大，樣品消耗多，目前還少有系統(tǒng)的研究報(bào)道。毛細(xì)管電泳（CE）具有高分辨率、快速分離、樣品用量小、篩選成本低的優(yōu)勢(shì)，是核酸適配體篩選的有效方法。本研究以人血清中脫鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白（A-TF）為模式蛋白，利用CE方法研究核酸庫(kù)長(zhǎng)度、孵育溫度、緩沖溶液的種類與pH值、金屬離子等因素對(duì)靶蛋白與核酸庫(kù)相互作用的影響。結(jié)果表明，較短序列的核酸庫(kù)與靶蛋白的親和力更高;孵育溫度、緩沖液種類與pH值均影響靶蛋白與核酸復(fù)合物的形成;低濃度的K+、Ca2+與Mg2+可促進(jìn)復(fù)合物形成?；趦?yōu)化的篩選條件，經(jīng)過(guò)3輪毛細(xì)管電泳法篩選，獲得了A-TF的適配體 Seq A3，采用CE-LIF測(cè)得復(fù)合物的親和常數(shù)KD=0.476 μmol/L。此適配體可用于人血清基質(zhì)中A-TF的識(shí)別。

關(guān)鍵詞?脫鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白;核酸適配體篩選;影響因素;毛細(xì)管電泳;指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化

1?引 言

核酸適配體（Aptamer）是通過(guò)指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化（SELEX）技術(shù)體外篩選獲得的寡核苷酸序列[1]，具有類似抗體的高親和力和高特異性的優(yōu)點(diǎn)，且穩(wěn)定性好，容易制備及修飾。核酸適配體的靶標(biāo)范圍廣，包括金屬離子、小分子、蛋白質(zhì)、細(xì)胞、微生物、病毒等。以蛋白質(zhì)為靶標(biāo)的核酸適配體篩選一直受到廣泛關(guān)注，蛋白質(zhì)的適配體在生物醫(yī)學(xué)、藥物研發(fā)、醫(yī)學(xué)影像和生物檢測(cè)等領(lǐng)域的應(yīng)用已有大量報(bào)道[2～4]。由于核酸適配體篩選過(guò)程復(fù)雜，影響因素多（如蛋白的天然形態(tài)和蛋白濃度以及影響蛋白活性的溶液體系、pH值、離子、其它共存蛋白等），篩選過(guò)程的環(huán)境因素直接影響適配體的篩選效率以及適配體的實(shí)用性能，因此分析篩選適配體的影響因素，優(yōu)化篩選條件，是提高篩選效率的關(guān)鍵問(wèn)題之一。

文獻(xiàn)報(bào)道了通過(guò)計(jì)算生物學(xué)建立數(shù)學(xué)模型優(yōu)化適配體篩選的環(huán)境參數(shù)和預(yù)測(cè)篩選結(jié)果，研究者分析了靶標(biāo)濃度[5，6]、復(fù)合物與游離核酸庫(kù)的分離效率[7]、靶標(biāo)與核酸序列的非特異性結(jié)合[8]，以及負(fù)篩步驟等單因素對(duì)篩選效率的影響[9]。但每引入一個(gè)參數(shù)變量，計(jì)算量會(huì)巨增[10]，普通的篩選者無(wú)法使用類似的數(shù)學(xué)模型完成篩選條件的優(yōu)化和預(yù)測(cè)，特別是數(shù)學(xué)模型的預(yù)測(cè)結(jié)果最終仍需大量實(shí)驗(yàn)結(jié)果加以驗(yàn)證。McKeague等[11]比較了429篇文獻(xiàn)中的SELEX實(shí)驗(yàn)條件，認(rèn)為靶標(biāo)與孵育溫度對(duì)適配體的親和力影響最大，溶液中Mg2+濃度也有重要影響。目前，絕大多數(shù)的核酸適配體的篩選條件都是參考前期文獻(xiàn)中的篩選條件[12～14]。實(shí)際上，不同蛋白質(zhì)的性質(zhì)、結(jié)構(gòu)和功能不盡相同，需針對(duì)特定蛋白研究篩選環(huán)境的條件因素影響，設(shè)計(jì)針對(duì)性的篩選條件，以提高篩選效率?？赡苁怯捎诔Ｒ?guī)的實(shí)驗(yàn)和方法系統(tǒng)研究多種因素的影響需要極大的工作量和樣品消耗，目前還很少有較系統(tǒng)的研究報(bào)道。

毛細(xì)管電泳（CE）技術(shù)具有高分辨、快速分離、樣品用量小、篩選成本低的優(yōu)勢(shì)，是核酸適配體篩選的有效方法。本課題組長(zhǎng)期致力于毛細(xì)管電泳篩選核酸適配體的策略和方法研究[15]，積累了大量用于蛋白質(zhì)適配體篩選的毛細(xì)管電泳特征圖譜，建立了多種毛細(xì)管電泳高效篩選模式，使蛋白質(zhì)的核酸適配體篩選效率顯著提高。轉(zhuǎn)鐵蛋白（Transferrin，TF）是血漿中主要的含鐵蛋白，在跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)中起著至關(guān)重要的作用[16]。脫鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白（Apo-transferrin，A-TF）是轉(zhuǎn)鐵蛋白的全脫鐵狀態(tài)，具有多種功能，如螯合游離鐵將藥物遞送至快速生長(zhǎng)的細(xì)胞、激活免疫細(xì)胞和防止細(xì)胞凋亡等[17，18]，但至今還沒(méi)有利用CE進(jìn)行核酸適配體篩選的報(bào)道。利用CE可系統(tǒng)研究和優(yōu)化適配體的篩選條件，并進(jìn)行高效篩選。本研究考察了單鏈核酸庫(kù)（ssDNA）的序列長(zhǎng)度、蛋白與核酸庫(kù)的孵育溫度、緩沖液的種類與pH值、金屬離子等因素對(duì)靶蛋白與核酸序列相互作用的影響。在優(yōu)化的篩選條件下，經(jīng)過(guò)3輪CE-SELEX篩選，得到A-TF的適配體seq A3。此適配體對(duì)A-TF有良好的親和力和特異性，可用于血清中的A-TF識(shí)別。

2?實(shí)驗(yàn)部分

2.1?儀器與試劑

Beckman P/ACE MDQ毛細(xì)管電泳儀配熒光檢測(cè)器（美國(guó)Beckman-coulter公司）;MicroCal iTC200微量熱等溫滴定量熱儀（英國(guó)馬爾文儀器公司）;PICO 21低溫離心機(jī)（美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司）;?S1000TM Thermal Cycler PCR儀、凝膠電泳儀（美國(guó)BIO-RAD公司）;75 μm內(nèi)徑熔融石英毛細(xì)管（邯鄲市鑫諾光纖色譜有限公司）。

H3BO3、Na2B4O7、NaOH、NaCl、KCl（分析純，北京化工廠）;?NaH2PO4、Na2HPO4（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）;三羥甲基氨基甲烷（Tris）、CaCl2（天津市津科化工研究所）;A-TF、人血清白蛋白（Human serum slbumin，HSA）、人血紅蛋白（Hemoglobin，HGB）（Sigma-Aldrich公司）。實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水（ddH2O）

55、69、80和100 nt FAM標(biāo)記ssDNA核酸庫(kù)：5-FAM-AGC AGC ACA GAG GTC AGA TG-（15N，29N，40N or 60N）-CCT ATG CGT GCT ACC GTG AA-3（兩端為20 nt引物區(qū)，中間為隨機(jī)序列）。引物P1：5-AGC AGC ACA GAG GTC AGA TG-3，標(biāo)記熒光的引物5-FAM-P1：FAM-5-AGC AGC ACA GAG GTC AGA TG-3），引物P2：5-TTC ACG GTA GCA CGC ATA GG-3（生工生物工程（上海）股份有限公司）。2×Taq Plus PCR Master Mix、dd H2O、500 μL Nuclelc Acid Dye Gene Green、1mL 6×DNA Loading Buffer、300 μL 50 bp DNA Ladder、50 g瓊脂糖（天根生化科技有限公司）。

2.2?實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1?溶液配制?（1）毛細(xì)管電泳分離溶液?50 mmol/L硼酸硼砂緩沖液（pH 8.7）。（2）蛋白與核酸孵育溶液?1/15 mol/L Na2HPO4-KH2PO4溶液（pH 4.92、5.91、6.64、7.17、7.38、7.73、8.43、8.98）;PBS、Tris-HCl、TGK、Na2HPO4-KH2PO4緩沖液（pH 7.4）。（3）蛋白與核酸溶液?蛋白質(zhì)用孵育緩沖溶液稀釋。固體粉末核酸庫(kù)用純水溶解，配制成100 μmol/L的母液，于94℃變性處理5 min，然后以0.5℃/s冷卻至25℃。

2.2.2?毛細(xì)管電泳分析條件?75 μm內(nèi)徑毛細(xì)管（ 50.2 cm/40 cm），使用前依次用1 mol/L NaOH、0.1 mol/L NaOH 和蒸餾水沖洗30 min進(jìn)行活化;LIF檢測(cè)器激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)520 nm;50 mmol/L硼酸鹽電泳緩沖液（pH 8.7）;0.5 psi（1 psi=6.89 kPa），進(jìn)樣5 s;分離電壓20 kV，溫度25℃。

2.2.3?PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物純化?（1）PCR條件?300 nmol/L引物P1、P2各6 μL，收集模板2 μL，2×Taq PCR Master Mix 25 μL，ddH2O 11 μL。95℃預(yù)變性5 min，變性10 s，59℃退火20 s，72℃延伸30 s;循環(huán)20次后，72℃后延伸10 min。（2）PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳?取RCR產(chǎn)物5 μL與6×DNA Loading Buffer 1 μL混合均勻后依次注入凝膠進(jìn)樣孔，80 V下電泳30 min，用凝膠成像分析儀拍照記錄。（3）PCR產(chǎn)物濃縮?PCR產(chǎn)物于2.0 mL的離心管中，加入40 μL 3 mol/L醋酸鈉溶液（pH 5.2）混勻;加入20℃預(yù)冷的900 μL無(wú)水乙醇混勻，15000 r/min離心15 min;加入70%乙醇洗滌沉淀，棄乙醇，沉淀干燥;（4）PCR產(chǎn)物回收?切下瓊脂糖凝膠電泳上所需條帶，轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管中，離心后于20℃冰凍20 min，搗碎;加入500 μL ddH2O，振搖多次;加入500 μL Tris飽和純苯酚，振搖后離心;取新離心管，加入500 μL 氯仿-異戊醇（24∶1，V/V），再加入上清液，振搖后離心;取新離心管，加入無(wú)水乙醇900 μL、 3 mol/L醋酸鈉20 μL，加入上清液后混勻，離心，棄去上清液，沉淀物于室溫風(fēng)干。

2.2.4?序列分析與親和力表征?高通量測(cè)序由生工生物公司完成，使用DNAman軟件分析序列二級(jí)結(jié)構(gòu)。CE法計(jì)算核酸序列與蛋白的結(jié)合比。利用GraphPad Prism 6 軟件按1∶1模型，擬合非線性飽和曲線，計(jì)算平衡解離常數(shù)（Dissociation constant，KD）。

2.2.5?CE法驗(yàn)證親和力與特異性?將篩選的核酸適配體序列加入含有A-TF（0.1～2 μmol/L）的人血清50倍稀釋液樣本中，37℃孵育20 min。以CE-LIF檢測(cè)復(fù)合物，計(jì)算適配體序列與A-TF的結(jié)合比，利用Origin 2018軟件，對(duì)結(jié)合百分比隨A-TF濃度變化擬合非線性飽和曲線，計(jì)算KD。相同條件下，將核酸適配體序列分別與HSA、HGB孵育，利用CE-LIF分析核酸適配體的特異性。

3?結(jié)果與討論

3.1?不同長(zhǎng)度隨機(jī)序列的核酸庫(kù)與蛋白A-TF和HSA的結(jié)合分析

目前報(bào)道的篩選用核酸庫(kù)的隨機(jī)序列含堿基數(shù)最短22 nt[19]，最長(zhǎng)200 nt[20]，應(yīng)用最普遍的是40～70 nt[11]。Velez等[21]驗(yàn)證了核酸酶對(duì)不同長(zhǎng)度核酸序列的催化活性，但有關(guān)核酸庫(kù)序列長(zhǎng)度對(duì)靶標(biāo)復(fù)合物形成和適配體篩選的影響還沒(méi)有系統(tǒng)的研究報(bào)道，而通過(guò)CE電泳圖可評(píng)價(jià)不同長(zhǎng)度核酸庫(kù)與A-TF結(jié)合的差異，分析核酸庫(kù)長(zhǎng)度對(duì)A-TF-核酸復(fù)合物形成的影響。圖1為A-TF分別與4個(gè)不同隨機(jī)序列長(zhǎng)度（60、40、29和15 nt）核酸庫(kù)ssDNAN60、ssDNAN40、ssDNAN29、ssDNAN15孵育后的混合物的電泳圖。與初始ssDNAN60核酸庫(kù)峰高相比，加入A-TF后，4.6 min處的ssDNAN60核酸庫(kù)峰高沒(méi)有明顯降低，也沒(méi)有明顯的復(fù)合物峰出現(xiàn)。ssDNAN40的結(jié)果與ssDNAN60相似。但更短的核酸庫(kù) ssDNAN29、ssDNAN15與A-TF混合物的電泳圖中，可見(jiàn)核酸庫(kù)峰高有明顯降低，且3～4 min區(qū)間有明顯的復(fù)合物包峰，其隨A-TF濃度增加而增大。以HSA蛋白為對(duì)照蛋白，將A-TF換成HSA蛋白，結(jié)果與A-TF相似（圖1B）。兩種蛋白均與短序列的核酸庫(kù)有結(jié)合，使核酸庫(kù)峰降低并形成較明顯的復(fù)合物峰，說(shuō)明較短的核酸庫(kù)中存在較多可與兩種靶蛋白結(jié)合的序列，它們分別形成A-TF-ssDNA復(fù)合物和HSA-ssDNA復(fù)合物。目前大量的篩選實(shí)驗(yàn)均使用ssDNAN60或ssDNAN40，但并未有選擇依據(jù)的說(shuō)明或研究。從CE電泳圖可見(jiàn)，核酸庫(kù)長(zhǎng)度對(duì)復(fù)合物的形成有明顯影響，說(shuō)明不同序列長(zhǎng)度的核酸庫(kù)對(duì)蛋白的結(jié)合能力有所不同，但是否會(huì)影響最佳適配體的篩選目前并無(wú)報(bào)道。根據(jù)此前的研究結(jié)果，適配體篩選前應(yīng)對(duì)核酸庫(kù)長(zhǎng)與蛋白靶標(biāo)的結(jié)合進(jìn)行評(píng)估，以優(yōu)選核酸庫(kù)和其它篩選條件?？紤]到評(píng)估的效率和成本，CE無(wú)疑是最佳方法。本實(shí)驗(yàn)以長(zhǎng)度居中的隨機(jī)序列長(zhǎng)度29 nt（研究最充分的人凝血酶的適配體的長(zhǎng)度），總長(zhǎng)度69 nt的ssDNAN29核酸庫(kù)研究適配體篩選的影響因素。

3.2?孵育溫度對(duì)A-TF-ssDNA和HSA-ssDNA 復(fù)合物形成的影響

單鏈核酸具有很大的柔性，其結(jié)構(gòu)易受環(huán)境因素影響，如溶液溫度會(huì)顯著影響其二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，也影響其與靶標(biāo)的結(jié)合能力。適配體篩選前需要對(duì)核酸庫(kù)進(jìn)行高溫變性和低溫復(fù)性，以保持其穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)并能與蛋白結(jié)合。孵育溫度不僅影響篩選過(guò)程中靶標(biāo)與核酸的結(jié)合，也影響實(shí)際應(yīng)用中適配體對(duì)靶標(biāo)的識(shí)別效果，因此篩選適配體時(shí)必須考慮孵育溫度的影響。文獻(xiàn)報(bào)道中常用的孵育溫度為4℃、25℃和37℃。4℃時(shí)大部分的細(xì)胞或蛋白可保持活性[22，23];25℃是室溫條件[24，25]，是常規(guī)實(shí)驗(yàn)用溫度;37℃則是生理溫度[26，27]?？疾炝?種孵育溫度對(duì)兩種蛋白的復(fù)合物形成的影響。由圖2A可見(jiàn)，隨孵育溫度升高，A-TF-ssDNA復(fù)合物峰明顯增加，37℃形成的復(fù)合物最多。HSA復(fù)合物形成情況相似。因此，溫度變化對(duì)適配體與蛋白的結(jié)合影響很大。篩選適配體的溫度條件與應(yīng)用適配體的溫度條件如果不一致，可能會(huì)使適配體因結(jié)構(gòu)變化而導(dǎo)致親和力弱化甚至喪失，CE分析結(jié)果為此提供了參考。目前很多文獻(xiàn)報(bào)道的適配體，在應(yīng)用時(shí)效果不佳甚至沒(méi)有親和力，部分原因可能是篩選條件和應(yīng)用環(huán)境的不一致，包括篩選和應(yīng)用時(shí)不同溫度的影響。

3.3?緩沖溶液組成和pH值對(duì)A-TF-ssDNA復(fù)合物形成的影響

蛋白與核酸庫(kù)孵育的緩沖溶液及pH值也影響復(fù)合物的形成。緩沖溶液和pH的選擇并沒(méi)有明確的標(biāo)準(zhǔn)和依據(jù)，篩選者所用溶液條件多參考前期的文獻(xiàn)[28]。常用緩沖溶液有PBS、Tris-HCl、TGK、Na2HPO4-KH2PO4等，分別在這些溶液中將A-TF與ssDNA混合孵育。由圖3A可見(jiàn)，在Na2HPO4-KH2PO4中，A-TF與核酸形成明顯的復(fù)合物包峰，其它3種溶液中則未檢出復(fù)合物峰。改變Na2HPO4-KH2PO4溶液的pH值 （pH 4.92～8.98），該復(fù)合物峰無(wú)明顯變化（圖3B），說(shuō)明此緩沖液中，pH值對(duì)A-TF與核酸的結(jié)合影響較小，表明A-TF與ssDNA庫(kù)孵育可選用的溶液pH范圍很寬，有利于適配體的篩選和實(shí)際應(yīng)用。

3.4?金屬離子對(duì)A-TF-ssDNA復(fù)合物形成的影響

溶液中一定濃度的陽(yáng)離子可以穩(wěn)定核酸的二級(jí)結(jié)構(gòu)[29]，中和ssDNA骨架上的負(fù)電荷，排除其與蛋白質(zhì)的靜電作用，但也可能影響蛋白質(zhì)的荷電性和二級(jí)或三級(jí)結(jié)構(gòu)，繼而影響蛋白與ssDNA的結(jié)合[24]。已有報(bào)道，金屬離子對(duì)蛋白與ssDNA的結(jié)合有明顯的影響[30]，但系統(tǒng)的研究方法和報(bào)道不多。目前報(bào)道的適配體篩選溶液中，通常含有Na+、K+、Ca2+、Mg2+或幾種陽(yáng)離子的組合。K+、Ca2+、Mg2+濃度為1～5 mmol/L[31，32]，Na+濃度為2～150 mmol/L[33～35]。比較了溶液中K+、Ca2+與Mg2+對(duì)A-TF-ssDNA 復(fù)合物形成的影響。由圖4A可見(jiàn)，溶液中K+為0～1 mmol/L時(shí)，電泳圖中有復(fù)合物峰。K+大于10 mmol/L，復(fù)合物包峰消失。溶液中含1 mmol/L Ca2+與1 mmol/L K+相似，但含10～50 mmol/L Ca2+時(shí)，復(fù)合物峰幾乎消失，而含100～150 mmol/L Ca2+時(shí)，又出現(xiàn)更大的復(fù)合物峰（圖4B），說(shuō)明不同濃度的Ca2+對(duì)復(fù)合物形成的影響不同。推測(cè)是由于高濃度的Ca2+ 可能影響A-TF或核酸的二級(jí)結(jié)構(gòu)，但具體原因還需進(jìn)一步探討。而Mg2+濃度的影響與K+非常相似（圖4C），與同為二價(jià)的Ca2+的影響有明顯差異。CE的分析結(jié)果表明，篩選中使用1～5 mmol/L K+、Ca2+、Mg2+可促進(jìn)復(fù)合物的形成。由于CE的背景緩沖液為50 mmol/L硼酸硼砂緩沖液（pH 8.7），含有50 mmol/L Na+，故分離過(guò)程中也可保持一定的離子濃度。上述結(jié)果也表明，不同的蛋白質(zhì)篩選適配體時(shí)，篩選溶液中的金屬離子對(duì)蛋白與核酸結(jié)合的影響可能存在很大差異，篩選時(shí)應(yīng)考慮溶液中離子種類和強(qiáng)度的影響。此外，在不同的實(shí)際樣品環(huán)境中，陽(yáng)離子類型和濃度復(fù)雜多變，所篩選的適配體的結(jié)構(gòu)可能受其影響而改變，進(jìn)而影響適配體與靶蛋白的結(jié)合。因此，適配體在應(yīng)用時(shí)如果效果不佳，甚至沒(méi)有親和力，離子種類和強(qiáng)度可能也是影響原因之一。

3.5?分析電壓和溫度對(duì)復(fù)合物分離的影響

對(duì)蛋白與核酸庫(kù)孵育的混合物進(jìn)行CE分析，可根據(jù)CE電泳圖譜快速、直觀地評(píng)估蛋白-ssDNA復(fù)合物的形成及定性評(píng)價(jià)結(jié)合強(qiáng)弱。進(jìn)一步考察了電泳分離過(guò)程中分離電壓和分離溫度對(duì)復(fù)合物穩(wěn)定性的影響。以50 mmol/L硼酸硼砂緩沖液（pH 8.7）為背景溶液，改變分離溫度（15℃～45℃）和分離電壓（15～30 kV），比較復(fù)合物峰的變化。當(dāng)分離溫度由15℃逐漸增加至45℃，ssDNA和復(fù)合物的遷移速度明顯加快，遷移時(shí)間明顯縮短，且二者的峰形尖銳，柱效明顯提高。在30℃～45℃分離溫度下，復(fù)合物的峰面積保持不變，說(shuō)明A-TF-ssDNA復(fù)合物穩(wěn)定，結(jié)果與孵育溫度37℃形成的復(fù)合物最多一致。增加分離電壓也可加快分離速度，30 kV電壓可使復(fù)合物的遷移時(shí)間縮短到2 min。因此，在優(yōu)化的溶液條件下，使用較高的分離溫度（35℃～37℃）和較高電壓可加快復(fù)合物的分離速度，節(jié)省分離時(shí)間。

3.6?A-TF的核酸適配體篩選

在優(yōu)化的CE條件下（緩沖液10 mmol/L Na2HPO4-KH2PO4，pH 7.17，含0.1 mmol/L Mg2+，37℃孵育10 min），用總長(zhǎng)為69 nt的ssDNAN29核酸庫(kù)篩選A-TF的核酸適配體。第1輪篩選用10 μmol/L A-TF與1 μmol/L ssDNAN29庫(kù)混合孵育。收集復(fù)合物，經(jīng)不對(duì)稱PCR擴(kuò)增，ssDNA純化，得到次級(jí)庫(kù)（Sub1-ssDNA）用于第2輪篩選。第2輪篩選用5 μmol/L A-TF與Sub1-ssDNA次級(jí)庫(kù)混合。其CE結(jié)果見(jiàn)圖6A。3.8～5.4 min區(qū)間有復(fù)合物峰，收集復(fù)合物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物的凝膠電泳如圖6A右圖所示。由于ssDNAN29樣品的模板濃度過(guò)高，其PCR產(chǎn)物條帶彌散，而擴(kuò)增產(chǎn)物R2條帶長(zhǎng)度在50～100 bp之間，為目標(biāo)產(chǎn)物。切膠回收純化后，獲得了新的次級(jí)庫(kù)Sub2-ssDNA，用于第3輪篩選。第3輪篩選用2.5 μmol/L A-TF與Sub2-ssDNA次級(jí)庫(kù)混合。如圖6B所示，3.6～5.2 min區(qū)間為復(fù)合物峰。收集復(fù)合物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物的凝膠電泳如圖6B右圖所示，其中R3為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，而擴(kuò)增產(chǎn)物R3條帶長(zhǎng)度在50～100 bp之間，為目標(biāo)產(chǎn)物。

將第3輪篩選得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行高通量測(cè)序。選擇出現(xiàn)頻數(shù)最高的3條序列Seq A1～Seq A3，用M-fold模擬序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，這些序列普遍呈莖環(huán)結(jié)構(gòu)（圖7A）。對(duì)3條序列Seq A1、Seq A2、Seq A3用 CE方法表征親和力

并計(jì)算其復(fù)合物的KD值。根據(jù)A-TF與3條序列的結(jié)合百分比，用1∶1結(jié)合模型做線性擬合，得到Seq A1、Seq A2、Seq A3的KD值分別為3.338、1.550和0.476 μmol/L（圖7B）。選親和力最高的Seq A3為其適配體。

3.7?Seq A3用于血清中A-TF的特異性識(shí)別和檢測(cè)

A-TF為血清蛋白，HSA、HBG也是血清中高豐度蛋白，故在血清樣品中驗(yàn)證Seq A3對(duì)A-TF的高親和和特異性識(shí)別。在3份稀釋50倍的人血清樣品中分別加入1 μmol/L的A-TF、HSA和HBG，得到3個(gè)加標(biāo)的血清稀釋樣品。分別將0.2 μmol/L的Seq A3加入3個(gè)樣品，在37℃孵育20 min，用CE-LIF分析。由圖8A可見(jiàn)，Seq A3可與含A-TF的樣品形成明顯的復(fù)合物（PA），而含HSA和HBG的樣品中未見(jiàn)明顯的復(fù)合物峰，說(shuō)明在稀釋的血清基質(zhì)中，Seq A3對(duì)A-TF有特異性的識(shí)別。分別在稀釋血清中加入0.1，0.2，0.5，1，2，5 μmol/L A-TF，將0.2 μmol/L Seq A3作為熒光探針與其混合。隨著A-TF濃度的增加，游離Seq A3峰降低，而復(fù)合物（PA）峰增加（圖8B），加入A-TF的濃度與Seq A3峰的降低百分比呈線性關(guān)系（圖8C）。說(shuō)明篩選的Seq A3可識(shí)別血清中的A-TF，其用于實(shí)際檢測(cè)還需進(jìn)一步深入研究。

4?結(jié) 論

核酸適配體篩選過(guò)程復(fù)雜，影響篩選的因素很多。分析篩選因素的影響，優(yōu)化篩選條件，是提高篩選效率的關(guān)鍵。毛細(xì)管電泳是直觀、快速、優(yōu)化篩選條件的有效方法?；诿?xì)管電泳方法可系統(tǒng)研究核酸庫(kù)隨機(jī)序列長(zhǎng)度、蛋白與核酸庫(kù)的孵育溫度、緩沖液種類與pH值、金屬離子等因素對(duì)靶蛋白與核酸序列相互作用的影響，并可用于篩選條件優(yōu)化。毛細(xì)管電泳方法較常規(guī)篩選方法大大減少了工作量和研究成本，可用于蛋白質(zhì)靶標(biāo)的適配體篩選條件研究，方法具有普適性。A-TF是重要的生物功能蛋白，其核酸適配體Seq-A3可以選擇性識(shí)別人血清基質(zhì)中的A-TF。

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