汪少麗 王英姿 王洪濤 劉保友 史大臣

摘要： 用不同濃度的γ-聚谷氨酸對(duì)6種植物病原菌（葡萄白腐病菌、櫻桃莖腐病菌、小麥紋枯病菌、黃瓜灰霉病菌、花生褐斑病菌、蘋果輪紋病菌）的抑菌效果和毒力進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，在16.67 g/L質(zhì)量濃度下，γ-聚谷氨酸對(duì)葡萄白腐病菌的相對(duì)抑制率最高，為73.10%，其次是對(duì)櫻桃莖腐病菌的相對(duì)抑制率為63.09%，而對(duì)小麥紋枯病菌、黃瓜灰霉病菌、花生褐斑病菌、蘋果輪紋病菌的相對(duì)抑制率則較低，分別為39.18%、33.16%、32.64%、24.54%。毒力測(cè)定發(fā)現(xiàn)，γ- 聚谷氨酸對(duì)葡萄白腐病菌的毒力最強(qiáng)，EC50為12.803 0 g/L，其次是對(duì)于櫻桃莖腐病菌、花生褐斑病菌、小麥紋枯病菌、黃瓜灰霉病菌的毒力，其EC50分別為13.624 1、18.336 0、18.773 5、23.600 7 g/L，對(duì)蘋果輪紋病菌的毒力最弱，其EC50為34.490 3 g/L。

關(guān)鍵詞： γ-聚谷氨酸;植物病原真菌;菌絲生長(zhǎng)法;相對(duì)抑制率;室內(nèi)毒力測(cè)定

中圖分類號(hào)： S432.4+4? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2020）05-0110-03

γ-聚谷氨酸（γ-polyglutamic acid，簡(jiǎn)稱γ-PGA）是一類由芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)生的胞外多肽，最早于1937年被發(fā)現(xiàn)，存在于炭疽芽孢桿菌的外莢膜中[1]，1942年Bovarnick發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌也能夠產(chǎn)生γ-聚谷氨酸[2]。γ-聚谷氨酸作為一種新型可生物降解的水溶性高分子材料[3]，已被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、化工、污水處理等領(lǐng)域[4-7]，是一種具有極大開發(fā)價(jià)值和應(yīng)用前景的新型多功能生物制品。

近年來，γ-聚谷氨酸及其衍生物在農(nóng)業(yè)中得到越來越多的應(yīng)用，尤其在土壤和肥料等方面發(fā)展迅速。如張新民等研究發(fā)現(xiàn)，γ-聚谷氨酸是一種優(yōu)良的土壤保水劑[8];汪家銘發(fā)現(xiàn)，γ-聚谷氨酸不僅能夠提高肥料的利用率，還能夠延長(zhǎng)肥料在土壤中的釋放周期[9]。但目前關(guān)于γ-聚谷氨酸對(duì)農(nóng)作物病原真菌的作用研究卻鮮有報(bào)道。本研究選擇6種主要植物病原真菌（葡萄白腐病菌、櫻桃莖腐病菌、小麥紋枯病菌、黃瓜灰霉病菌、花生褐斑病菌、蘋果輪紋病菌）進(jìn)行γ-聚谷氨酸的抑菌試驗(yàn)，分別測(cè)定γ-聚谷氨酸對(duì)這6種病原真菌的毒力，旨在為進(jìn)一步研究γ-聚谷氨酸抑制病原真菌機(jī)制提供理論基礎(chǔ)，同時(shí)，也為γ-聚谷氨酸應(yīng)用于農(nóng)作物病原真菌的田間防治提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試藥劑

γ-聚谷氨酸由煙臺(tái)市佳益有機(jī)肥料有限公司提供，由芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)生。

1.1.2 供試菌種

供試菌種主要有葡萄白腐病菌（Coniothyrium diplodiella）、櫻桃莖腐病菌（Phytophthora nicotianae）、小麥紋枯病菌（Rhizotonia cerealis）、黃瓜灰霉病菌（Botrytis cinerea）、花生褐斑病菌（Cercospora arachidicola Hori）、蘋果輪紋病菌（Botryosphaeria dothidea），均由山東省煙臺(tái)市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院提供，經(jīng)活化培養(yǎng)后保存在4 ℃冰箱，所用培養(yǎng)基為常規(guī)PDA培養(yǎng)基。

1.2 試驗(yàn)方法

供試藥劑對(duì)病原菌的毒力測(cè)定采用菌絲生長(zhǎng)速率法。將供試藥劑γ-聚谷氨酸加入到融化的PDA培養(yǎng)基中，配制成5個(gè)不同質(zhì)量濃度（6.67、8.30、10.00、12.50、16.67 g/L）的帶藥平板培養(yǎng)基，以無菌水作空白對(duì)照。在活化好的6種植物病原菌菌株的菌落邊緣用滅菌的打孔器打取直徑為 0.5 cm 的菌絲塊，分別移到帶藥平板培養(yǎng)基上，每處理設(shè)置5個(gè)重復(fù)。在25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 5～7 d 后，采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，計(jì)算菌落直徑平均值和菌絲生長(zhǎng)抑制率。

抑制率=（對(duì)照組菌落直徑-0.5 cm）-（含藥組菌落直徑-0.5 cm） 對(duì)照組菌落直徑-0.5 cm×100%。

1.3 數(shù)據(jù)分析

將菌絲生長(zhǎng)抑制率換算成機(jī)率值（y），藥劑濃度換算成質(zhì)量濃度對(duì)數(shù)（x），按質(zhì)量濃度對(duì)數(shù)與機(jī)率值回歸法求得線性回歸方程：y=a+bx，并以回歸方程計(jì)算γ-聚谷氨酸對(duì)6種植物病原菌的抑制中濃度（EC50）、機(jī)率值與質(zhì)量濃度對(duì)數(shù)之間回歸的相關(guān)系數(shù)（r），數(shù)據(jù)利用Excel、DPS分析軟件進(jìn)行方差分析和差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 γ-聚谷氨酸對(duì)6種植物病原菌的抑制率

γ-聚谷氨酸的5個(gè)試驗(yàn)質(zhì)量濃度對(duì)葡萄白腐病菌、櫻桃莖腐病菌、小麥紋枯病菌、黃瓜灰霉病菌、花生褐斑病菌、蘋果輪紋病菌的菌絲生長(zhǎng)均具有不同的抑制作用，菌落擴(kuò)展直徑均小于對(duì)照。其中，γ-聚谷氨酸的質(zhì)量濃度范圍為6.67～16.67 g/L時(shí)對(duì)葡萄白腐病菌的抑制作用最強(qiáng)，菌絲擴(kuò)展直徑范圍為 1.77～5.15 cm，抑制率范圍為21.57%～73.10%;對(duì)櫻桃莖腐病菌的抑制作用次之，其菌絲擴(kuò)展直徑范圍為2.70～7.08 cm，抑制率范圍為3.20%～63.09%，對(duì)于小麥紋枯病菌、黃瓜灰霉病菌、花生褐斑病菌、蘋果輪紋病菌的抑制作用則依次減弱，抑制率范圍分別為5.24%～39.18%、9.55%～33.16%、0.40%～32.64%、2.89%～24.54%（表1）。

2.2 γ-聚谷氨酸對(duì)不同病原菌的毒力測(cè)定

2.2.1 γ-聚谷氨酸對(duì)不同植物病原菌的抑制率中濃度比較

由表2可知，γ-聚谷氨酸對(duì)葡萄白腐病菌及櫻桃莖腐病菌的EC50較小，分別為 12.803 0、13.624 1 g/L，表現(xiàn)出較強(qiáng)的毒力，對(duì)花生褐斑病菌、小麥紋枯病菌、黃瓜灰霉病菌的毒力次之，其EC50分別為18.336 0、18.773 5、23.600 7 g/L，而對(duì)蘋果輪紋病菌的EC50最大，為34.490 3 g/L，表現(xiàn)出弱毒力。

2.2.2 γ-聚谷氨酸對(duì)6種植物病原菌的敏感性比較

殺菌劑室內(nèi)毒力測(cè)定中EC50越小、斜率越大說明病原菌對(duì)藥劑的反應(yīng)靈敏度越高，即隨著藥劑濃度的增加，抑制率明顯增大。但有研究表明，回歸方程的斜率與病原菌對(duì)殺菌劑的敏感性成正比[10-11]。本研究中γ-聚谷氨酸對(duì)葡萄白腐病菌、櫻桃莖腐病菌、花生褐斑病菌、小麥紋枯病菌、黃瓜灰霉病菌、蘋果輪紋病菌的毒力回歸方程的斜率分別為3.609 7、6.093 6、6.075 2、3.282 2、2.368、2.859 9（圖1）。由此可見，供試藥劑回歸方程的斜率與病原菌對(duì)殺菌劑的敏感性非正相關(guān)，其原因還須后期田間試驗(yàn)結(jié)果的驗(yàn)證。

3 結(jié)論與討論

γ-聚谷氨酸作為一種芽孢桿菌代謝產(chǎn)物，不僅在農(nóng)業(yè)肥料應(yīng)用中具有良好效果，在殺蟲劑、除草劑、驅(qū)蟲劑等農(nóng)藥中適量添加也能夠延長(zhǎng)這些藥物在作物表面的停留時(shí)間，使作物葉片表面的農(nóng)藥不容易因?yàn)楦稍?、下雨而流失，從而提高農(nóng)藥作用效果[12]。但目前關(guān)于γ-聚谷氨酸對(duì)于植物病原真菌直接的生長(zhǎng)抑制作用研究鮮有報(bào)道。王啟軍曾證實(shí)由枯草芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)生的γ-聚谷氨酸對(duì)于玉米小斑病菌生長(zhǎng)并無抑制效果[13]。劉俊研究發(fā)現(xiàn)，因?yàn)棣?聚谷氨酸具有很強(qiáng)的黏性，可以吸附大量的陽離子，從而增強(qiáng)生防菌菌體之間的聚集和吸附能力，增加植物的抗病性，但這些報(bào)道并未證實(shí)γ-聚谷氨酸對(duì)于病原真菌的菌絲生長(zhǎng)具有抑制作用[14]。而本研究結(jié)果表明，γ-聚谷氨酸對(duì)6種不同植物病原真菌的菌絲生長(zhǎng)具有不同的抑制作用，且對(duì)于不同植物病原真菌亦具有不同的毒力，其毒力由大到小排序?yàn)槠咸寻赘【?櫻桃莖腐病菌>花生褐斑病菌>小麥紋枯病菌>黃瓜灰霉病菌>蘋果輪紋病菌，其中以γ-聚谷氨酸對(duì)葡萄白腐病菌的菌絲生長(zhǎng)抑制作用最強(qiáng)，EC50為 12.803 0 g/L。但γ-聚谷氨酸對(duì)于不同病原真菌菌絲生長(zhǎng)的具體是通過形成高分子膜包被菌絲從而抑制菌絲的延展還是通過對(duì)菌體細(xì)胞的直接破壞毒殺作用而完成的[15]，目前仍不清楚，這也是后期要進(jìn)行深入探索研究的。

葡萄白腐病菌、櫻桃莖腐病菌、小麥紋枯病菌、黃瓜灰霉病菌、花生褐斑病菌、蘋果輪紋病菌是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的重要病害，對(duì)農(nóng)作物產(chǎn)量和品質(zhì)影響極大。目前對(duì)上述病害的防治仍以化學(xué)防治為主，但由于用藥不科學(xué)，多年持續(xù)使用單一藥劑，造成病原菌對(duì)一些殺菌劑已產(chǎn)生了不同程度的抗藥性[16-17]。因此，一些新型綠色生物農(nóng)藥的研制對(duì)于防治上述病害迫在眉睫，γ-聚谷氨酸無污染、無殘留、無抗藥性，其對(duì)于植物病蟲害防治的研究已成為近年來的研究熱點(diǎn)，本研究結(jié)果為從芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)物中提取γ-聚谷氨酸并將其作為新型農(nóng)藥的應(yīng)用提供了研究基礎(chǔ)。

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收 稿日期：2019-02-12

基金項(xiàng)目：山東省煙臺(tái)市科技計(jì)劃（編號(hào)：2017NC022）;山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新工程（編號(hào)：CXGC2016B11）;山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系果品產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)病蟲防治與質(zhì)量控制崗位專家專項(xiàng)（編號(hào)：SDAIT-06-11）。

作者簡(jiǎn)介：汪少麗（1989—），女，山東煙臺(tái)人，博士，農(nóng)藝師，主要從事植物病害防治及機(jī)理研究。Tel：（0535）6352015;E-mail：shaoliwang123@126.com。

通信作者：王英姿，研究員，碩士生導(dǎo)師，主要從事果樹、蔬菜植物保護(hù)等研究。Tel：（0535）6352015;E-mail：ytnkyzbs@yt.shandong.cn。