田娟 孫墨可 董玉迪 郭來春 王春龍 張曼

摘要： 研究了冷處理、基因型、消毒方法和不同培養(yǎng)基等對燕麥成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明，在種子消毒前，4 ℃冰箱冷處理3 d最為合適;在進(jìn)行種子消毒時先用75%乙醇處理10 min，無菌水沖洗5 min，再用10%次氯酸鈉（NaClO，有效氯濃度≥10%）處理15 min，無菌水沖洗5 min的方法;在配制誘導(dǎo)培養(yǎng)基時，應(yīng)選擇W14為基本培養(yǎng)基，添加2 mg/L 2，4-D、1 mg/L NAA、500 mg/L水解酪蛋白（CH）、30 g/L蔗糖、6 g/L植物凝膠，這樣才會得到更高的出愈率。在愈傷組織分化時，6-BA的質(zhì)量濃度為0.5 mg/L最佳。

關(guān)鍵詞： 燕麥;成熟胚;愈傷組織;誘導(dǎo);2，4-D;6-BA;水解酪蛋白

中圖分類號： S512.604.3? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）05-0057-04

燕麥（Avena sativa L.），又名莜麥、雀麥、野麥子等，屬禾本科（Gramineae）燕麥屬（Avena L.），一年生草本植物[1]，是一種集飼用、營養(yǎng)、藥用于一身的特色雜糧作物，對畜牧業(yè)發(fā)展和生態(tài)建設(shè)都具有重要意義[2-3]。國內(nèi)在燕麥方面的研究主要集中在品種選育[4-5]、栽培技術(shù)[6-8]等。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，對改良植物品質(zhì)、增強(qiáng)植物抗性等方面，利用植物基因工程是一項(xiàng)行之有效的方法，進(jìn)行轉(zhuǎn)基因育種的前提是建立高效穩(wěn)定的組織培養(yǎng)再生體系[9]。在燕麥方面，已有不少學(xué)者以花藥[10]、穎片[11]、幼穂[12]、幼胚[13]、成熟胚[14-15]為材料建立了燕麥再生體系，成熟胚與其他材料相比，材料豐富，保存期長，易于獲取，且不受植株發(fā)育時期和季節(jié)等因素的限制，具備取材方便、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)，是進(jìn)行燕麥基因轉(zhuǎn)化的良好受體。為此，本試驗(yàn)以燕麥成熟胚為試驗(yàn)材料，通過對不同消毒方法、不同基因型、不同基本培養(yǎng)基、不同2，4-D濃度及冷處理等方面的研究，探索影響燕麥成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)的因素，篩選適宜于燕麥成熟胚培養(yǎng)的培養(yǎng)基，旨在提高愈傷組織分化和再生能力。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試品種為吉林省白城市農(nóng)業(yè)科學(xué)院選育的白燕11號（B11）和從加拿大引進(jìn)的燕麥品種JA3。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 不同燕麥種子消毒方法消毒效果的比較

選取成熟籽粒飽滿的燕麥JA3種子，用自來水沖洗0.5 h，在超凈工作臺內(nèi)，先用75%乙醇處理3～15 min，無菌水沖洗5 min，再用10%次氯酸鈉（NaClO，有效氯濃度≥10%）處理10～30 min，無菌水沖洗 5 min。放入25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，接種后的第15天調(diào)查記錄污染數(shù)和出愈情況。培養(yǎng)基為MS+4 mg/L 2，4-D+1 mg/L NAA+30 g/L蔗 糖+6 g/L植物凝膠，pH值為5.8。

1.2.2 不同培養(yǎng)基對愈傷組織誘導(dǎo)的影響

選用不同基因型JA3和B11的成熟胚，將燕麥種子置于4 ℃冰箱中3 d后用處理5（表1）消毒，分別接種到不同的培養(yǎng)基上：不同組合（表2）+30 g/L蔗糖+6 g/L 植物凝膠+500 mg/L水解酪蛋白（CH），pH值為5.8。放入25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)15 d后，記錄出現(xiàn)的愈傷組織數(shù)。計算其出愈率，選擇最適的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，分析不同基因型、不同基本培養(yǎng)基、不同2，4-D濃度對燕麥成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)的影響。

1.2.3 水解酪蛋白

以JA3為試驗(yàn)對象，在誘導(dǎo)處理1培養(yǎng)基中添加500 mg/L水解酪蛋白（CH），以誘導(dǎo)處理1培養(yǎng)基作對照，15 d后觀察記錄愈傷組織的出愈率。

1.2.4 低溫處理

以JA3為試驗(yàn)對象，將燕麥種子置于4 ℃冰箱中處理1、2、3、4 d，室溫下未處理的種子作為對照，處理5消毒后接種在組合7培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件均放入25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)。15 d后觀察記錄愈傷組織的出愈率。

1.2.5 愈傷組織分化培養(yǎng)基的選擇

有文獻(xiàn)記載6-BA對愈傷組織分化影響最大[16]，為系統(tǒng)地探討6-BA對愈傷組織分化的影響，以W14為基本培養(yǎng)基附加不同質(zhì)量濃度的6-BA（分別為0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L）和30 g/L蔗糖+6 g/L植物凝膠+500 mg/L水解酪蛋白（CH）+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L KT，pH值為5.8。置于（25±1） ℃下光照培養(yǎng)，光照度為1 500～2 000 lx，光周期16 h/d，接種后12 d統(tǒng)計分化率。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel和SPSS統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。

污染率=污染種子數(shù)/接種種子總數(shù)×100%;

出愈率=出現(xiàn)愈傷組織外植體數(shù)/接種外植體總數(shù)×100%;

分化率=出現(xiàn)苗的愈傷組織數(shù)/轉(zhuǎn)移的愈傷組織總數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒處理比較

由表1可知，所有的處理組合都沒有污染，都可以有效消毒，但是不同處理JA3的出愈率有所不同，可能是乙醇或者次氯酸鈉的消毒時間過長對外植體造成損傷影響出愈情況。處理5的出愈率最高，達(dá)到62.50%，處理4的出愈率最低，僅 16.67%。在乙醇處理時間相同的情況下，次氯酸鈉消毒時間越長，出愈率越低，對外植體的損傷越嚴(yán)重。

2.2 不同基本培養(yǎng)基對愈傷組織誘導(dǎo)的影響

在植物組織培養(yǎng)中，愈傷組織的產(chǎn)生是整個組織培養(yǎng)的基礎(chǔ)，培養(yǎng)基是最為關(guān)鍵的影響因素。統(tǒng)計2種培養(yǎng)基的出愈率情況（表2）可以看出，在其他條件都相同的情況下，基本培養(yǎng)基W14要比基本培養(yǎng)基MS出愈率更高。由表3可以看出，培養(yǎng)基對愈傷組織出愈率的影響極顯著（P=0.002<0.01）。

2.3 不同基因型對愈傷誘導(dǎo)的影響

由表2可以看出，不同燕麥基因型成熟胚的最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基不同。JA3的最適愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基組合為W14+3 mg/L 2，4-D+1 mg/L NAA，B11的最適愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基組合為W14+2 mg/L 2，4-D+1 mg/L NAA。由表3可以看出，基因型對出愈率的影響達(dá)到了極顯著水平（P<0.01）。

2.4 不同質(zhì)量濃度2，4-D對愈傷組織誘導(dǎo)的影響

由表2、表3可以看出，2，4-D質(zhì)量濃度對出愈率的影響極顯著。2種基本培養(yǎng)基中都是隨著2，4-D質(zhì)量濃度增加出愈率先升高后降低，在2 mg/L時出愈率最高，在MS中平均出愈率達(dá)到73.08%，在W14中平均出愈率達(dá)到88.23%。不同基因型

2，4-D的最適質(zhì)量濃度不同，JA3的最適質(zhì)量濃度為3 mg/L，B11的最適質(zhì)量濃度為2 mg/L。

2.5 水解酪蛋白

由圖1可以看出，添加500 mg/L水解酪蛋白處理下JA3的出愈率為81.16%，不添加水解酪蛋白處理下JA3的出愈率為62.50%，這表明水解酪蛋白在燕麥成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)中可以提高其出愈率。

2.6 低溫處理

由圖2可以看出，對照組中JA3出愈率為 81.16%，隨著處理天數(shù)的增加出愈率明顯增加，當(dāng)冷處理3 d時出愈率達(dá)到最高水平（96.70%），這表明適當(dāng)?shù)牡蜏靥幚恚? ℃處理3 d）在燕麥成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)中可以提高其出愈率。

2.7 不同質(zhì)量濃度6-BA對愈傷組織分化的影響

在不同質(zhì)量濃度6-BA的培養(yǎng)基中愈傷組織分化結(jié)果如表4所示，隨著質(zhì)量濃度增加，分化率降低。分化率最高的質(zhì)量濃度為0.5 mg/L，平均分化率為41.38%;1 mg/L中的平均分化率為34.41%;1.5 mg/L中的平均分化率為33.72%;2 mg/L中的平均分化率為30.56%。其中，在相同質(zhì)量濃度 6-BA 的培養(yǎng)基中，B11的分化率要比JA3的分化率高，說明B11的分化能力比較強(qiáng)。本研究中的分化率不高，沒有達(dá)到50%，除了與基因型和培養(yǎng)基有關(guān)外，可能與愈傷組織的質(zhì)量有關(guān)，在誘導(dǎo)出愈傷組織后可以轉(zhuǎn)移到繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代培養(yǎng)，改善愈傷組織后再進(jìn)行分化。

3 討論與結(jié)論

低溫具有增加核酸含量、誘導(dǎo)其蛋白質(zhì)合成的效應(yīng)[16]，還能改善幼穗及花藥的出愈狀態(tài)[17]。本試驗(yàn)表明，適當(dāng)?shù)牡蜏靥幚恚? ℃處理3 d）在燕麥成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)中可以提高其出愈率。

種子表面滅菌處理可以創(chuàng)造一個無菌環(huán)境，有利于愈傷組織的形成。在燕麥愈傷組織誘導(dǎo)中常用的消毒劑有氯化汞、乙醇和次氯酸鈉。消毒劑的選擇和處理時間長短對試驗(yàn)?zāi)芊癯晒Ψ浅ｊP(guān)鍵。李建民等采用的是乙醇和氯化汞相結(jié)合的消毒方法[18-20]，可以有效消毒，但是氯化汞有劇毒，容易對身體造成傷害，也容易對環(huán)境造成污染。羅志娜等選用不同濃度乙醇和次氯酸鈉相結(jié)合的消毒方法也可以有效消毒[21-22]。本研究選用對人和環(huán)境友好的乙醇和次氯酸鈉，選出了最佳的消毒組合：先用75%乙醇處理10 min，無菌水沖洗5 min，再用10%次氯酸鈉（NaClO，有效氯濃度≥10%）處理 15 min，無菌水沖洗5 min，不僅能夠有效地消毒，而且不會對外植體造成損傷影響出愈情況。

常用的基本培養(yǎng)基有多種，胡曉旭比較了基本培養(yǎng)基MS和N6，結(jié)果表明，在2種不同的基礎(chǔ)培養(yǎng)基上進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)差異顯著，MS上愈傷組織的出愈率和成活率明顯高于N6培養(yǎng)基[23];李建民等在MS、B5、N6、改良N6（N6培養(yǎng)基中的鹽酸硫胺改為0.4 mg/L，肌醇與MS同量）4種培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在4種培養(yǎng)基上種子胚均被誘導(dǎo)形成了愈傷組織，誘導(dǎo)率最高的為改良N6培養(yǎng)基[18]。本研究對比了W14和MS這2種基本培養(yǎng)基，結(jié)果顯示，在其他條件都相同的情況下，基本培養(yǎng)基W14要比MS出愈率高，并且基本培養(yǎng)基對愈傷組織出愈率的影響極顯著。

在禾本科植物愈傷組織誘導(dǎo)中，2，4-D通常是起決定作用的植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)[24-25]。Hassan等通過研究認(rèn)為，2，4-D與愈傷的形成相關(guān)，能促進(jìn)愈傷的生長[26]。Kim等研究得出只有適量濃度的2，4-D才會增加外植體的出愈率，使用過量或低濃度少量使用都不利于愈傷組織的形成[27]。本試驗(yàn)用JA3和B11成熟胚為材料，2種基本培養(yǎng)基中添加2 mg/L 2，4-D時出愈率最高，在MS中平均出愈率達(dá)73.08%，在W14中平均出愈率達(dá)到88.23%，明顯高于其他質(zhì)量濃度，所以添加2 mg/L 2，4-D 為最佳質(zhì)量濃度;但是不同基因型的最適 2，4-D 質(zhì)量濃度不同，JA3的最適質(zhì)量濃度為 3 mg/L，B11的最適質(zhì)量濃度為2 mg/L，這與羅志娜等的結(jié)論[21]一致。所以在誘導(dǎo)燕麥成熟胚愈傷組織時，2，4-D的質(zhì)量濃度要根據(jù)基因型不同適量選擇，建議質(zhì)量濃度為2～3 mg/L。

有研究表明，水解酪蛋白（CH）可以提高燕麥愈傷組織誘導(dǎo)率、改善愈傷組織的質(zhì)量和提高再生率[22，28]。本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，500 mg/L CH有助于提高燕麥愈傷組織的出愈率。

在植物組織培養(yǎng)中，6-BA的主要功能是促進(jìn)細(xì)胞的分裂和芽的形成，其活性較強(qiáng)，對于產(chǎn)生花粉胚狀體有明顯的提高作用，而對于分化成苗 6-BA 可以起到主導(dǎo)作用。本研究設(shè)置了0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L這4個不同質(zhì)量濃度的6-BA，試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著質(zhì)量濃度增加，分化率降低，在愈傷分化時，0.5 mg/L 6-BA為最佳質(zhì)量濃度。

綜上所述，在進(jìn)行燕麥愈傷組織誘導(dǎo)時，種子消毒前于4 ℃冰箱冷處理3 d最為合適;在進(jìn)行種子消毒時先用75%乙醇處理10 min，無菌水沖洗 5 min，再用10%次氯酸鈉（NaClO，有效氯濃度≥10%）處理 15 min，無菌水沖洗5 min的方法;在配制誘導(dǎo)培養(yǎng)基時，應(yīng)選擇W14為基本培養(yǎng)基，添加2 mg/L 2，4-D、1 mg/L NAA、500 mg/L水解酪蛋白（CH），這樣才會得到更高的出愈率;在愈傷分化時，6-BA的質(zhì)量濃度為0.5 mg/L最佳。

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收 稿日期：2019-01-24

基金項(xiàng)目：國家燕麥?zhǔn)w麥產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（編號：CARS-08）。

作者簡介：田 娟（1985—），女，吉林松原人，碩士，研究實(shí)習(xí)員，主要從事生物技術(shù)育種。E-mail：tianjuanyes@126.com。

通信作者：張 曼，助理研究員，主要從事生物技術(shù)育種。E-mail：ashuan19870324@126.com