周 雪，劉幸卉，盧澤鈺，尹少妹，聶勁鵬，周文成

創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎(postraumatic osteoarthritis，PTOA)以關(guān)節(jié)內(nèi)骨折、交叉韌帶撕裂、半月板損傷為主。早期軟骨細(xì)胞壞死，導(dǎo)致細(xì)胞支架外露及對應(yīng)力耐受減弱，在炎癥影響下加速軟骨細(xì)胞壞死、加重軟骨基質(zhì)降解，導(dǎo)致軟骨退變[1]。而膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)腔灌洗有助于清除關(guān)節(jié)腔內(nèi)碎屑、小游離體及致炎因子，減緩自身免疫反應(yīng)，減少滑膜炎癥，消除滑膜水腫，降低膝關(guān)節(jié)內(nèi)壓。研究發(fā)現(xiàn),在鉆孔時采用不同灌洗液可增加滲透壓及降低Ca2+濃度，利于保護(hù)軟骨細(xì)胞，其中以含有5 mmol/L Mg2+灌洗液效果最佳[2]。 Zeng et al[3]指出,關(guān)節(jié)鏡術(shù)后單次關(guān)節(jié)腔內(nèi)Mg2+注射有利于緩解疼痛，增強局部麻醉藥布比卡因鎮(zhèn)痛作用，增強軟骨細(xì)胞活力，對軟骨有一定保護(hù)作用。基于Mg2+不僅具有抗炎鎮(zhèn)痛作用，而且對軟骨具有保護(hù)作用，我們采用兔膝關(guān)節(jié)鉆孔構(gòu)造PTOA模型，比較分析400 mOsm/L硫酸鎂和氯化鈉持續(xù)灌洗2 h對PTOA軟骨損傷修復(fù)的影響，為PTOA的預(yù)防及治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物選取5～6月齡清潔級雌性新西蘭白兔18只，體重2.4～3.0 kg(由湖北醫(yī)藥學(xué)院動物實驗中心提供)，分籠顆粒飼料喂養(yǎng)，自由飲水，生活環(huán)境溫度(22±1)℃，自然光照與黑暗時間為12 h交替。

1.2 材料硫酸鎂粉劑、氯化鈉粉劑和戊巴比妥鈉粉劑(Sigma公司)；青霉素和RNA提取試劑盒(廣州行知生物技術(shù)有限公司);反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCRMix試劑盒(Thermo Fisher公司);YX-091210R兔白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、YX-201407R兔腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、YX-031514R兔Ⅱ型膠原蛋白(CollagenⅡ)、金屬蛋白酶-3(MMP-3)，ELISA 96T試劑盒(上海優(yōu)選生物科技公司)；HE染色、Masson三色染色及阿利新藍(lán)染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；qPCR檢測使用ABI公司StepOnePlus型檢測系統(tǒng)；所有引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1動物分組 將18只右膝行股骨髁間鉆孔構(gòu)造PTOA模型的實驗兔隨機分為3組，每組6只。① PTOA組：未予關(guān)節(jié)內(nèi)灌洗，為模型對照組；② 氯化鈉組：采用滲透壓400 mOsm/L的氯化鈉溶液持續(xù)灌洗2 h；③ 硫酸鎂組：采用滲透壓400 mOsm/L的硫酸鎂溶液持續(xù)灌洗2 h，該硫酸鎂溶液濃度為20 mmol/L，加入氯化鈉及蒸餾水調(diào)整滲透壓至400 mOsm/L。

1.3.2動物手術(shù)及關(guān)節(jié)腔灌洗 3%戊巴比妥鈉(1.5 ml/kg)經(jīng)兔耳緣靜脈注射麻醉,雙側(cè)膝關(guān)節(jié)備皮。手術(shù)范圍常規(guī)消毒,無菌操作下取右膝前內(nèi)側(cè)2～3 cm弧形切口,采用? 1.5 mm鉆頭鉆孔，注意止血。0.9%生理鹽水沖洗切口3遍，放置進(jìn)水管及出水管并縫線固定(見圖1)，緊密縫合傷口，在麻醉情況下分別采用400 mOsm/L硫酸鎂或氯化鈉溶液輸液式灌洗2 h后拔除進(jìn)、出水管，滴速為每分鐘60滴，灌洗量為500 ml。術(shù)前0.5 h及術(shù)后3 d連續(xù)肌注青霉素80萬U預(yù)防感染，皮膚碘伏消毒7 d。術(shù)后不固定患肢，置于標(biāo)準(zhǔn)動物飼養(yǎng)籠中允許其自由活動及進(jìn)食。

圖1 術(shù)中置入進(jìn)、出水管縫合固定后情況

1.3.3ELISA檢測關(guān)節(jié)腔積液IL-1β、TNF-α和CollagenⅡ的表達(dá) 在兔膝關(guān)節(jié)內(nèi)注射1 ml生理鹽水，屈伸活動膝關(guān)節(jié)后收集關(guān)節(jié)腔積液，及時在轉(zhuǎn)速3 000 r/min下離心15 min，收集上清液置于-80 ℃ 保存。按照相關(guān)儀器與ELISA檢測試劑盒步驟檢測IL-1β、TNF-α和CollagenⅡ。用Excel軟件制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，以吸光值作為縱坐標(biāo)，以濃度作為橫坐標(biāo)。實驗重復(fù)3次,取均值。

1.3.4qPCR檢測滑膜組織IL-1β、TNF-α、MMP-3基因表達(dá) 將提取到的各組滑膜組織總RNA用Oligo(dT)反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，經(jīng)特定的引物PCR擴增，并檢測內(nèi)參甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)。分別設(shè)計基因IL-1β、TNF-α、MMP-3(見表1)。qPCR反應(yīng)采用SYBR Green/ROX qPCRMasterMix(2X)，根據(jù)產(chǎn)品說明書配制PCR反應(yīng)液，每個樣品重復(fù)3個復(fù)孔。采用2-ΔΔCt法確定對應(yīng)循環(huán)數(shù)的Ct值，對每個目標(biāo)基因定量。實驗重復(fù)3次,取均值。

表1 qRT-PCR所用引物序列

1.3.5組織學(xué)觀察與骨關(guān)節(jié)炎(OA)評分標(biāo)準(zhǔn) 4周時收集各組積液固定于4%多聚甲醛，分級乙醇脫水，脫鈣、切片，石蠟包埋處理后組織切片(4 μm)；采用HE染色評價軟骨表面和細(xì)胞形態(tài)學(xué)，Masson三色染色評估蛋白膠原堆積及排列，阿利新藍(lán)染色評估蛋白聚糖分布情況。標(biāo)本在光學(xué)顯微鏡下觀察，并用數(shù)碼CCD攝像機記錄。所有染色方案按照供應(yīng)商操作指南。遵循雙盲原則進(jìn)行改良組織學(xué)OA評分，主要包括阿利新藍(lán)染色、軟骨組織、軟骨細(xì)胞密度、細(xì)胞解體，軟骨細(xì)胞簇的形成[4]。

2 結(jié)果

2.1 一般情況實驗期間各組動物無死亡，手術(shù)前后兔體重?zé)o明顯變化，術(shù)后1周手術(shù)切口紅腫基本消退，無滲出；術(shù)后2周傷口愈合良好，無感染。

2.2 組織學(xué)觀察見圖2。 HE染色后，硫酸鎂組在兔的軟骨組織表面比較光滑、維持良好軟骨細(xì)胞形態(tài)，而PTOA組與氯化鈉組有不同程度不平整、軟骨細(xì)胞排列紊亂和細(xì)胞簇的形成；Masson染色后，硫酸鎂組具有良好膠原纖維排列，而PTOA組及氯化鈉組關(guān)節(jié)表面有不同程度不平整、軟骨細(xì)胞排列紊亂，阿利新藍(lán)染色蛋白聚糖密度較高。OA評分：硫酸鎂組為1～6(3.33±2.33)分， PTOA組為6～9(8.14±1.29)分，氯化鈉組為7～9(8.42±1.04)分，硫酸鎂組與PTOA組、氯化鈉組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 ELISA檢測關(guān)節(jié)腔積液IL-1β、TNF-α和CollagenⅡ表達(dá)情況關(guān)節(jié)腔積液的IL-1β、TNF-α、CollagenⅡ表達(dá)硫酸鎂組低于PTOA組與氯化鈉組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。PTOA組與氯化鈉組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖3。

2.4 qPCR檢測滑膜組織IL-1β、TNF-α、MMP-3基因表達(dá)情況滑膜組織IL-1β、TNF-α、MMP-3基因表達(dá)硫酸鎂組低于PTOA組與氯化鈉組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。PTOA組與氯化鈉組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖4。

3 討論

PTOA早期軟骨細(xì)胞壞死導(dǎo)致細(xì)胞支架外露及對應(yīng)力耐受減弱，在炎癥影響下加速軟骨細(xì)胞壞死、加重軟骨基質(zhì)降解，導(dǎo)致軟骨退變[1]。前交叉韌帶重建恢復(fù)關(guān)節(jié)穩(wěn)定性術(shù)后并不能減少PTOA發(fā)生，關(guān)節(jié)內(nèi)炎癥在疾病演變過程起到關(guān)鍵作用[5-6]。與原發(fā)性O(shè)A不同，PTOA有明確受傷時間，可以確定早期干預(yù)時間，加強早期干預(yù)措施也許是預(yù)防PTOA主要出發(fā)點。本研究采用股骨髁間鉆孔構(gòu)建PTOA模型，與前交叉韌帶重建術(shù)股骨韌帶隧道相似，不破壞關(guān)節(jié)穩(wěn)定性，不涉及負(fù)重關(guān)節(jié)面，是針對關(guān)節(jié)內(nèi)炎癥研究良好模型，能排除關(guān)節(jié)不穩(wěn)定及關(guān)節(jié)面不平整等機械性因素加重關(guān)節(jié)內(nèi)炎癥。用輸液式灌洗法模擬關(guān)節(jié)鏡手術(shù)下持續(xù)灌洗，采用正常關(guān)節(jié)腔滲透壓值(400 mOsm/L)的灌洗液，在麻醉良好條件下持續(xù)灌洗2 h，與氯化鈉組比較，硫酸鎂組可降低滑膜組織炎癥因子IL-1β、TNF-α基因表達(dá)，減少關(guān)節(jié)腔積液中TNF-α分泌，同時滑膜組織中MMP-3基因表達(dá)也減少(MMP-3是一種軟骨蛋白聚糖降解酶，在OA滑膜或其積液中表達(dá)增高，促進(jìn)OA進(jìn)展)。

圖2 不同染色軟骨組織形態(tài)學(xué)觀察(×100)，從左至右分別為PTOA組、氯化鈉組、硫酸鎂組 A.HE染色；B.Masson三色染色；C.阿利新藍(lán)染色

圖3 ELISA檢測關(guān)節(jié)腔積液IL-1β、TNF-α、Collagen Ⅱ表達(dá)情況 A.積液IL-1β；B.積液TNF-α；C.積液Collagen Ⅱ；與硫酸鎂組比較：*P<0.05 圖4 qPCR檢測滑膜組織IL-1β、TNF-α、MMP-3基因表達(dá)情況 A.基因IL-1β；B.基因TNF-α；C.基因MMP-3；與硫酸鎂組比較：*P<0.05

目前研究[7-8]認(rèn)為，Mg2+攝入有利于預(yù)防OA。Mg2+是Ca2+內(nèi)流天然拮抗劑，其通過調(diào)控NMDAR Ca2+通道起到抗炎鎮(zhèn)痛效果，對軟骨起到保護(hù)作用[2, 9-10]。有研究表明，前期用硫酸鎂關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射，可抑制TRPV5表達(dá)，促進(jìn)軟骨自噬，有利于軟骨再生基因表達(dá)[11]。在相同濃度(20 mmol/L)下相較于氯化鎂，硫酸鎂更好地保護(hù)軟骨，減少CollagenⅡ、蛋白聚糖丟失。與生理鹽水相比，增加滲透壓及含Mg2+溶液有利于減少軟骨細(xì)胞壞死及Collagen Ⅱ的丟失[2，12]。本研究發(fā)現(xiàn)，與相同滲透壓的氯化鈉溶液相比，含20 mmol/L硫酸鎂溶液可以減少關(guān)節(jié)腔中CollagenⅡ丟失，在軟骨組織學(xué)上OA評分較低，能對軟骨起到保護(hù)作用，其機制可能是通過抑制Ca2+通道NMDAR調(diào)控軟骨細(xì)胞新陳代謝和凋亡[9]。

綜上所述，與相同滲透壓下氯化鈉溶液相比，硫酸鎂溶液可以減輕關(guān)節(jié)內(nèi)炎癥，對軟骨退變起到保護(hù)作用，有利于延緩PTOA病情進(jìn)展。然而，增加持續(xù)灌洗時間或增加硫酸鎂濃度對關(guān)節(jié)內(nèi)炎癥及軟骨退變的影響有待進(jìn)一步研究。