汪勇剛

骨肉瘤是兒童和青少年中最常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤[1]。20世紀(jì)初期，骨肉瘤5年生存率不到20%，隨著輔助化療、放療手段和手術(shù)技術(shù)的進(jìn)步，局部骨肉瘤患者的長期生存率已提高到約60%[2]。然而，腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移是大多數(shù)骨肉瘤患者死亡的首要原因，無轉(zhuǎn)移骨肉瘤患者的5年生存率為70%，當(dāng)臨床出現(xiàn)轉(zhuǎn)移時，骨肉瘤患者的5年生存率不到30%[3]。因此探尋新的治療靶點和方法來抑制骨肉瘤發(fā)展、轉(zhuǎn)移并改善預(yù)后具有十分積極的意義。miRNA是長21～25 nt的非編碼RNA分子，其通過靶向結(jié)合mRNA的3′非翻譯區(qū)(3′UTR)來抑制轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平表達(dá)，發(fā)揮致癌基因或抑癌基因的功能，與骨腫瘤、胃癌、肺癌等多種腫瘤發(fā)生進(jìn)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[4]。目前，miRNA已成為基因治療骨肉瘤的新研究熱點。本研究選取我院2011年1月～2013年1月病理科68例骨肉瘤患者的外檢檔案，旨在探討骨肉瘤組織中miR-194的表達(dá)水平及其與臨床病理參數(shù)的關(guān)系，以期為骨肉瘤新治療靶點的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 病例資料68例凍存骨肉瘤組織及其對應(yīng)的癌旁組織標(biāo)本(組織從體內(nèi)取出后立即儲存于液氮環(huán)境中)，男37例，女31例，年齡8～70(17.65±7.32)歲，病程1～24(5.62±1.54)個月。軟組織浸潤23例，無軟組織浸潤45例。腫瘤轉(zhuǎn)移39例，腫瘤無轉(zhuǎn)移29例。腫瘤位于股骨下端27例，脛骨上端20例，肱骨上端6例，其他部位15例。臨床分期(Enneking外科分期)：Ⅰ期15例，Ⅱa期18例，Ⅱb期17例，Ⅲ期18例。參照Dahlin標(biāo)準(zhǔn)的組織學(xué)分型：普通性中心型54例(骨母細(xì)胞型39例，軟骨母細(xì)胞型9例，纖維母細(xì)胞型6例)，血管擴(kuò)張型5例，小圓細(xì)胞型5例，骨旁型4例?；颊呤中g(shù)前均未行放療、化療，且患者臨床資料及術(shù)后隨訪資料均完整。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 熒光定量實時PCR(qRT-PCR)使用qRT-PCR檢測骨肉瘤及癌旁組織標(biāo)本中miR-194表達(dá)水平。使用TRIzol試劑(Invitrogen公司)從液氮凍存的組織提取總RNA。使用Reverse Transcription Kit(Takara公司)將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用SYBR Green(Takara公司)進(jìn)行實時PCR分析。利用ABI7500系統(tǒng)進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。以U6作為內(nèi)參。本研究引物設(shè)計均由上海生工合成，引物設(shè)計如下，miR-194：5′-GACTGAGTACAAACTGGTGG-3′；5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；U6：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′；5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。PCR反應(yīng)體系：使用50 μl PCR反應(yīng)體系，10X Buffer 5 μl，2.5 mmol/L dNTP 4 μl，taq酶0.5 μl，Pmix 2.5 μl，上游引物和下游引物各1 μl，ddH2O 36 μl。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性25 s，60 ℃退火35 s，72 ℃延伸20 s，31個循環(huán)。應(yīng)用2-ΔΔCt法計算miR-194相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 miR-194在骨肉瘤組織及癌旁組織中的表達(dá)情況與癌旁組織中miR-194的2～8(5.61±1.33)表達(dá)水平相比，骨肉瘤組織中miR-194的1～5(3.63±0.65)表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=8.408，P<0.001)。68例骨肉瘤組織中miR-194表達(dá)水平的平均值為3.63，以此作為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分組，27例標(biāo)本顯示較高水平miR-194表達(dá)，記為高表達(dá)組；41例標(biāo)本顯示較低水平miR-194表達(dá)，記為低表達(dá)組。

2.2 骨肉瘤組織中miR-194表達(dá)與臨床參數(shù)的關(guān)系見表1。骨肉瘤組織中miR-194的表達(dá)水平與患者性別、腫瘤大小和腫瘤部位等臨床參數(shù)無明顯關(guān)系(P>0.05)，而與患者年齡有明顯關(guān)系(P<0.05)。隨患者年齡的增加，miR-194表達(dá)水平上調(diào)。

表1 骨肉瘤組織中miR-194表達(dá)與臨床參數(shù)的關(guān)系(例)

2.3 骨肉瘤組織中miR-194表達(dá)與臨床分期的關(guān)系見表2。隨著臨床分期的增加，miR-194表達(dá)水平逐漸降低，miR-194的表達(dá)水平與臨床分期顯著相關(guān)(χ2=15.859，P=0.001)。與Ⅰ期、Ⅱa期患者相比，Ⅲ期患者miR-194表達(dá)水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=10.790，P=0.001；χ2=4.713，P=0.030)。Ⅱb期患者miR-194表達(dá)水平顯著低于Ⅰ期患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=6.149，P=0.013)。

表2 骨肉瘤組織中miR-194表達(dá)與臨床分期的關(guān)系(例)

2.4 骨肉瘤組織中miR-194表達(dá)與臨床特征的關(guān)系見表3。軟組織浸潤患者miR-194表達(dá)水平顯著低于無軟組織浸潤患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。與無轉(zhuǎn)移患者相比，轉(zhuǎn)移患者miR-194表達(dá)水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。

表3 骨肉瘤組織中miR-194表達(dá)與臨床特征的關(guān)系(例)

2.5 骨肉瘤組織中miR-194表達(dá)與組織學(xué)分型的關(guān)系見表4。miR-194在普通性中心型、血管擴(kuò)張型、小圓細(xì)胞型及骨旁型中的表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=3.723，P=0.590)。

表4 骨肉瘤組織中miR-194表達(dá)與組織學(xué)分型的關(guān)系(例)

2.6 骨肉瘤組織中miR-194表達(dá)與患者術(shù)后累積生存率的關(guān)系68例骨肉瘤患者隨訪時間6～48個月，22例死亡32.35%(22/68)。Kaplan-Meier生存曲線顯示，miR-194高表達(dá)組患者中位生存時間為30.40個月，累積生存率為81.48%(22/27)；而低表達(dá)組中位生存時間為23.71個月，累積生存率為58.54%(24/41)；兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=4.138，P=0.042)。見圖1。

圖1 miR-194表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系 兩組比較：χ2=4.138，P=0.042

3 討論

3.1 miRNA在腫瘤組織中作用骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展過程與多種致癌基因及抑癌基因的表達(dá)相關(guān)。致癌基因或抑癌基因表達(dá)異常通過調(diào)控細(xì)胞增殖、遷移參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程。miRNA靶向結(jié)合mRNA的3′UTR抑制轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平表達(dá)，通過調(diào)節(jié)其他腫瘤抑制因子或致癌基因表達(dá)而起致癌基因或抑癌基因的作用。生物信息學(xué)研究表明，1/3的已知基因可能被miRNA調(diào)控。自發(fā)現(xiàn)miRNA在秀麗隱桿線蟲發(fā)育中的作用以來，已觀察到大量miRNA譜系的異常表達(dá)與癌癥有關(guān)，包括骨腫瘤、結(jié)腸癌、乳腺癌、胃癌等。在癌癥中，miRNA調(diào)節(jié)異常影響下游靶點，并進(jìn)一步影響致瘤性發(fā)生如增殖、轉(zhuǎn)移和凋亡的常見特征[5]。因此，miRNA在腫瘤組織中的表達(dá)可作為診斷、治療和預(yù)后評估的新靶點。

3.2 miRNA在骨肉瘤中作用多種miRNA表達(dá)的上調(diào)或下調(diào)與骨肉瘤的發(fā)生、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Montanini et al[6]通過對骨肉瘤細(xì)胞系MG-63和143B進(jìn)行表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)，miR-93的高表達(dá)狀態(tài)促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移。有研究發(fā)現(xiàn)[7-8]miR-143表達(dá)的上調(diào)對骨肉瘤的轉(zhuǎn)移起抑制作用。Fei et al[9]發(fā)現(xiàn)，miR-9表達(dá)水平的上調(diào)與骨肉瘤TNM分期密切，且miR-9表達(dá)水平的降低與患者預(yù)后不良有關(guān)。Tian et al[10]發(fā)現(xiàn)，miR-34b表達(dá)水平的降低與患者患病風(fēng)險和腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。這些研究表明，miRNA可作為致癌基因或抑癌基因參與骨肉瘤發(fā)生進(jìn)展過程。

3.3 miR-194臨床研究結(jié)果miR-194是潛在的抑癌基因，通過下調(diào)多種靶標(biāo)，如SSH2、HBEGF、TLN2、CDH2、IGF1R等，起到腫瘤抑制基因的作用。miR-194在胃腸癌細(xì)胞中的過表達(dá)可抑制癌細(xì)胞的遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移[11]。靳雷 等[12]通過轉(zhuǎn)染miR-194模擬物增強(qiáng)骨肉瘤細(xì)胞系SOSP9607中miR-194的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，miR-194的上調(diào)能夠顯著抑制細(xì)胞增殖，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。白馬恒 等[13]通過構(gòu)建不同表達(dá)水平miR-194的骨肉瘤細(xì)胞系發(fā)現(xiàn)，miR-194能夠抑制骨肉瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。另外，杜香 等[14]通過構(gòu)建動物模型發(fā)現(xiàn)，miR-194可以抑制裸鼠體內(nèi)骨肉瘤的增殖及肺部轉(zhuǎn)移。這些研究提示，miR-194在骨肉瘤中起抑癌基因的作用。然而miR-194在骨肉瘤組織中的表達(dá)及其臨床病理或預(yù)后意義尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，骨肉瘤組織中miR-194的表達(dá)水平顯著降低，提示miR-194在骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展中可能起抑癌基因的作用。研究顯示miR-194的低表達(dá)與胃癌臨床晚期分期有關(guān)[15]。本研究通過分析miR-194與骨肉瘤患者臨床病理參數(shù)的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，隨著臨床分期的增加，miR-194表達(dá)水平逐漸降低，miR-194表達(dá)水平的下調(diào)與晚期臨床分期有關(guān)，提示癌組織中miR-194表達(dá)水平的下調(diào)與骨肉瘤的發(fā)病進(jìn)程相關(guān)，可預(yù)測骨肉瘤的發(fā)病進(jìn)展，并判斷患者的惡性程度。另外，軟組織浸潤和轉(zhuǎn)移患者組織中miR-194表達(dá)水平顯著降低，這與Cai et al[16]研究結(jié)果基本一致，提示腫瘤組織中miR-194表達(dá)水平的下調(diào)與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。王時光 等[17]發(fā)現(xiàn)，miR-194表達(dá)水平是結(jié)直腸癌患者預(yù)后的獨立危險因素，可作為結(jié)直腸癌診斷與預(yù)后判斷的生物標(biāo)志物。本研究對患者進(jìn)行Kaplan-Meier生存分析發(fā)現(xiàn)，miR-194高表達(dá)患者5年生存率顯著高于miR-194低表達(dá)患者，說明miR-194表達(dá)失調(diào)與骨肉瘤患者的生存預(yù)后密切相關(guān)，可作為骨肉瘤預(yù)后判斷的生物標(biāo)志物。

綜上所述，骨肉瘤組織中miR-194表達(dá)水平顯著下調(diào)，與患者臨床分期、軟組織浸潤、腫瘤轉(zhuǎn)移等臨床病理特征有關(guān)，其低表達(dá)與患者預(yù)后不良密切相關(guān)，可作為骨肉瘤預(yù)后判斷的生物標(biāo)志物。