吳梓斌 ，徐德忠 ，冷 欣 ，苗慶顯 ，肖旺釧 ，2

（1.福建農(nóng)林大學 材料工程學院，福建 福州350108；2.三明學院 資源與化工學院，福建 三明365004）

兩親性嵌段共聚物組裝形成的膠束應用于多種藥物的負載，是最有發(fā)展和應用前景的納米載體材料之一[1]。嵌段共聚物是利用有機化學和高分子化學合成的手段將兩種或幾種不同性質(zhì)的單體或聚合物鏈接起來，形成一種新的高分子聚合物，從而獲得更好的性能的材料。兩親性的高分子鏈段同時包含親水和疏水兩種化學結(jié)構，對油相和水相都具有很好的親和性，同時還具有高分子的增黏性和低分子的表面活性[2-3]。兩親性嵌段共聚物在油相溶液和水溶液中均會進行不同自組裝以使其適應當下的環(huán)境。在水溶液中，疏水性鏈段會盡可能減少與水溶液的接觸面積而團聚收縮形成類似于核結(jié)構，親水性鏈段則會盡可能增大與水溶液接觸面積而伸展形成類似殼結(jié)構，此為水溶液中兩親性膠束的自組裝形態(tài)。這種能自組裝為核-殼結(jié)構的聚合物膠束在難溶性藥物的遞送及藥物定位控制釋放[4]、基因治療[5]、蛋白質(zhì)分離與提取[6]、生物智能響應性傳感器[7]、診斷治療疾病[8]等領域具有非常好的應用前景。在藥物遞送方面，膠束載體的大小通常為十分之幾到幾百納米，以允許全身（靜脈內(nèi)）或局部（粘膜）給藥，并促進它們在細胞內(nèi)擴散。此外，膠束的表面功能改性可以賦予納米載體控制其藥代動力學和生物分布的能力，盡可能提高藥物在體內(nèi)的循環(huán)時間。

在藥物遞送研究領域，聚合物膠束由于其多樣性，譬如能夠增溶難溶性的藥物、減少藥物被腎濾系統(tǒng)清除、藥物緩慢釋放、減少藥物的毒副作用、藥物靶向遞送、提高藥物在體內(nèi)的循環(huán)時間等，倍受專家學者的研究和開發(fā)[9-11]。智能兩親性嵌段聚合物膠束會在特定的外界環(huán)境下表現(xiàn)出不同的響應性[12]，主要有以下響應，pH敏感[13-14]，溫度敏感[15]、光敏感[16]等。pH敏感型是指在某一pH值范圍之內(nèi)，鏈段的結(jié)構會發(fā)生了某種轉(zhuǎn)變的過程[17]。欒淑娟等制備合成mPEG-Hz-PLA嵌段共聚物，聚合物膠束能自組裝成具有核-殼結(jié)構的納米膠束。進一步研究了該聚合物的載藥能力和在不同pH值條件下藥物釋放的能力，以驗證其pH響應性[18]。溫度敏感型是指當在特定溫度發(fā)生變化時，聚合物某一鏈段從溶解到不溶解或者從不溶解到溶解以便藥物進行釋放[19]。郭莉等[20]以聚異丙基丙烯酰胺作為溫度敏感段、以聚丙烯酸作為pH敏感段成功制備了雙重敏感性的兩親性嵌段共聚物。該聚合物成功負載了抗癌藥物紫杉醇(PTX)，并進一步探究了載藥膠束在人體環(huán)境中的控釋行為。光度敏感性共聚物指在共聚物中含有感光性的鏈段，該感光鏈段在吸收光源之后，對該鏈段產(chǎn)生物理或者化學的變化，自行組裝的納米膠束結(jié)構發(fā)生轉(zhuǎn)變，使之對于藥物的負載更加的高效[21]。趙發(fā)寶等[22]以溴封端聚乙二醇單甲醚(mPEG-Br)為大分子引發(fā)劑，通過原子轉(zhuǎn)移自由基聚合 (ATRP)反應制備了不同嵌段比例且分子量分布較窄的光學活性聚乙二醇單甲醚嵌段聚(N-甲基丙烯酰-L-亮氨酸甲酯)(mPEG-b-PMALM)聚合物。就當前的研究情況分析，在響應性藥物靶向傳遞和可控釋放領域內(nèi)，pH響應性由于其特點引起了研究者的廣泛研究[23]。當聚合物膠束從血液進入到腫瘤細胞中，pH環(huán)境生變化會引起pH敏感的聚合物膠束發(fā)生變化，從而膠束解離，藥物釋放。聚酯類材料在人體內(nèi)的降解性良好，且生物的降解性也很好，在人體內(nèi)最終可以降解成二氧化碳和水，從而排出體外[24]。基于以上科學問題，本文擬設計一種低成本、合成工藝簡單且所得粒徑便于調(diào)控的新型兩親性嵌段共聚物PPEGMA-b-PtBMA。甲基丙烯酸聚乙二醇酯（PPEGMA）是作為該共聚物的親水嵌段，其具有無免疫原性及抗原性、無毒無害、能與眾多溶劑互溶、不易被蛋白質(zhì)和血小板吸附等優(yōu)點。甲基丙烯酸叔丁酯（tBMA）最為該共聚物的疏水嵌段，具有良好的生物相容性、價格低廉等優(yōu)點，且因其反應活性高、疏水性強廣泛應用于制備功能化微球和嵌段共聚物。因此本文采用兩步再生電子轉(zhuǎn)移生成催化劑原子轉(zhuǎn)移自由基聚合（ARGET ATRP）反應制備該兩親性嵌段共聚物。第一步ARGET ATRP反應是使用2-溴異丁酸乙酯作為引發(fā)劑對甲基丙烯酸聚乙二醇酯（PEGMA）進行修飾，并使單體（PEGMA）發(fā)生自聚，目的在其鏈段端引入溴原子得到具備引發(fā)功能的親水鏈段PPEGMA-Br；第二步ARGET ATRP反應是通過大分子引發(fā)劑PPEGMA-Br引發(fā)甲基丙烯酸叔丁酯（tBMA）聚合，從而得到兩親性嵌段共聚物PPEGMA-b-PtBMA，并對其進行結(jié)構的表征和藥物包埋、藥物控制釋放性能的測試。

1 實驗部分

1.1 藥品和儀器

1．1．1 藥品

甲基丙烯酸聚乙二醇酯（99%），甲基丙烯酸叔丁酯（99%），溴化銅（99%），2-溴異丁酸乙酯（99%），苯甲醚（99.7%），三(2-吡啶甲基)胺（98%），丙酮（98%），正己烷（97%），異辛酸亞錫（95%），鹽酸阿霉素（DOX）（99%），中性氧化鋁，以上試劑購買自阿拉丁，直接使用。

1．1．2 儀器

實驗所用儀器見表1。

表1 實驗中所用主要檢測儀器

1.2 實驗步驟

1．2．1 具有引發(fā)功能的聚甲基丙烯酸聚乙二醇酯（PPEGMA-Br）的合成

用電子天平稱取約4.6 mg三 (2-吡啶甲基)胺、3.6 mg溴化銅、3.84 g甲基丙烯酸聚乙二醇酯、31.2 mg 2-溴異丁酸乙酯和15 mL溶劑苯甲醚置于100 mL兩口燒瓶中，并將燒瓶置于超聲波清洗器中超聲分散。待溴化銅充分分散，將兩口燒瓶置于40℃的油浴鍋內(nèi)，并用反口塞密封兩口燒瓶。利用長針頭持續(xù)往兩口燒瓶內(nèi)注入高純氮氣，同時利用短針頭保持兩口燒瓶內(nèi)氣壓與大氣壓平衡。在另一個瓶子中加入160 μL異辛酸亞錫和3 mL苯甲醚，并注入氮氣進行保護，防止其氧化。待兩口燒瓶內(nèi)的反應持續(xù)45 min時，把瓶內(nèi)的異辛酸亞錫和苯甲醚混合液體注入兩口燒瓶中，并保持高純氮氣的持續(xù)注入。反應24 h，待冷卻后，將所得的反應產(chǎn)物逐滴加入到過量且快速攪拌的正己烷中，靜置后倒掉上清液，所得沉淀即為聚合物粗產(chǎn)物。進一步用過柱的辦法除去聚合物粗產(chǎn)物中的溴化銅，在玻璃柱中加入適量的中性氧化鋁，所得的聚合物粗產(chǎn)物用少量的丙酮溶解后，加入到玻璃柱中，用丙酮作為洗脫劑進行洗脫。過柱所得的液體用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進行蒸發(fā)濃縮，再次逐滴滴入過量正己烷中，所得沉淀用真空干燥箱干燥24 h待用。干燥后的固體即為PPEGMA-Br。

1．2．2 甲基丙烯酸聚乙二醇酯-甲基丙烯酸叔丁酯（PPEGMA-b-PtBMA）嵌段共聚物的合成

稱取 1 mmol的 PPEGMA-Br、0.05 mmol的溴化銅、0.05 mmol的三(2-吡啶甲基)胺、20 mmol的甲基丙烯酸叔丁酯和15 mL溶劑苯甲醚置于兩口燒瓶中。反應步驟與上述步驟大致相同。將兩口燒瓶置于40℃的油浴鍋內(nèi)攪拌45 min后，保持高純氮氣的持續(xù)注入條件下，快速注入0.5 mmol異辛酸亞錫和3 mL苯甲醚的混合物，持續(xù)反應24 h。待冷卻后，將所得的反應產(chǎn)物逐滴加入到過量且快速攪拌的正己烷中，靜置后倒掉上清液，所得沉淀即為聚合物粗產(chǎn)物。進一步用過柱的辦法除去聚合物粗產(chǎn)物中的溴化銅，在玻璃柱中加入適量的中性氧化鋁，所得的聚合物粗產(chǎn)物用少量的丙酮溶解后，加入到玻璃柱中，用丙酮作為洗脫劑進行洗脫。過柱所得的液體用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進行蒸發(fā)濃縮，再次逐滴滴入過量正己烷中，所得沉淀用真空干燥箱干燥24 h待用。所得的產(chǎn)物即為兩親性嵌段共聚物PPEGMA-b-PtBMA。

1．2．3 臨界膠束濃度（CMC）測定

近年來，快速發(fā)展的熒光探針技術是研究膠束體系的重要手段，其中最為常見的是以芘為熒光探針。首先，稱量芘2.4 mg溶于1 000 mL的甲醇，配置成1.2×10-5mol/L芘的甲醇溶液待用。將10 mg聚合物溶于少量丙酮中，再往里加入10 mL超純水，慢速攪拌24 h（揮發(fā)丙酮），從而獲得1 mg/mL的聚合物母液。隨后將母液稀釋成 5×10-1、2.5×10-1、1×10-1、7.5×10-2、5×10-2、2.5×10-2、1×10-2、7.5×10-3、5×10-3、2.5×10-3、1×10-3、7.5×10-4、5×10-4、2.5×10-4、1×10-4mg/mL 一系列濃度。 取 0.5 mL 芘的甲醇溶液置于相應數(shù)量的試樣瓶中，隨即伴隨著晃動試樣瓶通氮氣將甲醇吹干。往含芘的試樣瓶中加入10 mL聚合物的稀釋液超聲1 h并避光平衡24 h后進行測試。芘在樣品溶液中的濃度為6×10-7mol/L。用熒光分光光度計測試溶液的熒光激發(fā)光譜，對激發(fā)波長為337和335 nm數(shù)據(jù)進行記錄，以二者的比值為縱坐標，聚合物濃度求對數(shù)后數(shù)值為橫坐標作圖。

1．2．4 PPEGMA-b-PtBMA空白膠束以及載DOX膠束的制備

通過透析方法形成空白的聚合物膠束。將20 mgPPEGMA-b-PtBMA完全溶于5 mL丙酮中迅速攪拌5 h，然后超聲0.5 h。隨后，在劇烈攪拌下，以10 μL/s的速度向溶液中加入10 mL去離子水。將所得的溶液轉(zhuǎn)移至分子截留酯為8 000～12 000的透析24 h。在透析前6 h中每2 h更換一次去離子水，然后每6小時更換一次。 最后，將溶液冷凍干燥48 h得到固體產(chǎn)物，即為PPEGMA-b-PtBMA空白膠束。

載藥膠束的制備方法與上述方法相似。稱取2 mg鹽酸阿霉素置于小瓶，并用1 mL丙酮使其完全溶解。將20 mg PPEGMA-b-PtBMA完全溶于5 mL丙酮中迅速攪拌5 h，然后超聲0.5 h。隨后將鹽酸阿霉素的丙酮溶液加入至聚合物溶液劇烈攪拌，再以10 μL/s的速度向溶液中加入10 mL去離子水。 滴加結(jié)束后在避光的條件下將聚合物溶液轉(zhuǎn)移透析袋 （相對分子量分子量截留值為 8 000～12 000）中，用去離子水透析24 h。在透析前6 h中每 2 h更換一次去離子水，然后每6 h更換一次。 最后，將溶液冷凍干燥48 h得到固體產(chǎn)物，即為PPEGMA-b-PtBMA載DOX膠束。

1．2．5 載藥量和包封率的測定

將5 mg鹽酸阿霉素（DOX）溶解于5 mL丙酮中，配置成1 mg/mL的母液。隨后將母液配置成0.75、 0.50、0.25、0.10、0.075、0.05、0.025、0.01 mg/mL 一系列濃度。 用紫外分光光度計檢測其 485 nm處的吸光度，并繪制鹽酸阿霉素/丙酮的標準曲線。

將1 mg所制備的PPEGMA-b-PtBMA載藥膠束溶解于10 mL的丙酮中，使膠束形態(tài)發(fā)生變化（親水段為核，疏水段為殼），所載DOX溶解于丙酮中，隨后用紫外分光光度計檢測其485 nm處的吸光度，對比鹽酸阿霉素/丙酮的標準曲線，計算膠束的載藥量（LC）及包封率（EE）。

1．2．6 DOX 的體外釋放

用紫外/可見分光光度計來模擬計算載藥膠束的藥物釋放。具體方法如下，將一定量的載藥膠束裝入透析袋中，放入50 mL的釋放介質(zhì)在37℃的條件下進行透析。釋放介質(zhì)分別為0.1 mol/L，pH=7.4 的磷酸鹽緩沖溶液和 0.1 mol/L，pH=4.0 的磷酸鹽緩沖溶液。分別在時間為 0.5、1、3、6、9、12、24 h分別取樣3 mL，每次取樣后補充3 mL新鮮的釋放介質(zhì)。隨后用紫外分光光度計測其吸光度并計算出鹽酸阿霉素的濃度。

1.3 測試表征

（1）核磁共振表征：使用氘代氯仿（CDCl3-d）作為溶劑，四甲基硅烷（TMS）作為內(nèi)標，對聚合物的化學結(jié)構進行核磁共振檢測（1H-NMR，Bruker AVANCEⅢ 400）。

（2）粒徑分布測定：樣品的尺寸大小及分布采用英國馬爾文激光粒度儀Zetasizer Nano-ZS進行測定，分析空白膠束及載藥膠束的粒徑分布情況，并與透射電鏡觀察的膠束粒徑進行對比。

（3）透射電鏡分析：稱取一定量聚合物空白膠束及載藥膠束滴在銅網(wǎng)上，待其干燥后采用JEM-1010透射電鏡對其進行粒徑和形貌觀察。

（4）紫外/可見分光吸光度測試：測定波長為485 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 PPEGMA-b-PtBMA的合成

為了構建一種兩親性pH敏感的兩嵌段聚合物膠束作為藥物輸送載體，本文采用的ARGET ATRP法可獲得一種A-B型高分子PPEGMA-b-PtBMA，同時研究聚合物的載藥量、pH敏感性以及藥物釋放的情況。首先，在苯甲醚溶劑中，以三(2-吡啶甲基)胺/溴化銅為催化體系，異辛酸亞錫作為還原劑，2-溴異丁酸乙酯作為配體，以甲基丙烯酸聚乙二醇酯作為單體，用AGGET ATRP方法自聚，調(diào)控親水端的分子量的同時并引入了端基溴原子得到具有引發(fā)功能的大分子引發(fā)劑PPEGMA-Br，合成路線如圖1。然后對所得的大分子引發(fā)劑，再次使用AGGET ATRP方法接枝甲基丙烯酸叔丁酯，經(jīng)提純后即得聚合物PPEGMA-b-PtBMA。

圖1 PPEGMA-Br及 PPEGMA-b-PtBMA合成示意圖

為了進一步表征聚合物結(jié)構，以CDCl3為溶劑，采用核磁共振譜儀測定聚合PPEGMA-Br和PPEGMA-b-PtBMA的核磁氫譜。圖2為PPEGMA-Br及 PPEGMA-b-PtBMA的1H-NMR譜圖。從PPEGMA-Br的1H-NMR譜圖可見，化學位移為3.7（b）處是PEGMA鏈節(jié)上兩類亞甲基氫質(zhì)子化學位移峰，在1.95（a）處是PEGMA以2-溴異丁酸乙酯為引發(fā)劑自聚后引入的異丙基的氫質(zhì)子峰。經(jīng)過ARGET ATPR反應后，PPEGMA-b-PtBMA的譜圖中1.42（c）處出現(xiàn)叔丁基上的氫質(zhì)子峰。因此，可以判定兩親性聚合物PPEGMA-b-PtBMA成功合成。

圖2 PPEGMA-Br及 PPEGMA-b-PtBMA的核磁共振氫譜圖

2.2 臨界膠束濃度的測定

在藥物輸送的領域內(nèi)，臨界膠束濃度是一個極其重要的指標，用于評估聚合物膠束在體內(nèi)的穩(wěn)定程度。芘溶液的熒光光譜包含一個振動帶，對芘環(huán)境的極性具有很高的靈敏度。當膠束形成時，芘分子最好位于膠束的疏水核心內(nèi)或靠近其疏水核心，從而改變其光物理特性。以芘的熒光探針法測定PPEGMA-b-PtBMA聚合物自組裝成膠束的臨界膠束濃度。隨著PPEGMA-b-PtBMA濃度增加，芘的激發(fā)光譜強度不斷增加且第三個峰的位置發(fā)生化學位移，逐漸從335 nm轉(zhuǎn)移到337 nm。以I337和I335的比值為縱坐標、濃度對數(shù)為橫坐標作圖。從圖3可見，I337/I335急劇增加的轉(zhuǎn)折點即為聚合物的CMC值。PPEGMA-b-PtBMA的CMC值為5.0 mg/L。研究表明，隨著聚合物疏水嵌段的增長，在水溶液中，其自組裝為膠束的能力越強。本文所合成的PPEGMA-b-PtBMA聚合物具有較低的臨界膠束濃度，表明其水溶液的核-殼結(jié)構相對穩(wěn)定，即使?jié)舛容^低，亦能保持完整結(jié)構，有利于增長其在人體內(nèi)的循環(huán)時間。

圖3 PPEGMA-b-PtBMA的臨界膠束濃度圖

2.3 載藥膠束的制備與表征

由于PPEGMA-b-PtBMA具有優(yōu)異的兩親性能，可在水溶液中自組裝形成穩(wěn)定的膠束結(jié)構。親水性的PPEGMA鏈段作為膠束的外殼，疏水性的PtBMA鏈段作為膠束的內(nèi)核，使得該聚合物形成具有殼核結(jié)構的冠狀膠束。采用透析法制備PPEGMA-b-PtBMA載藥膠束。經(jīng)紫外/可見分光光度計表征載藥膠束的丙酮溶液，計算得知PPEGMA-b-PtBMA的載藥量（LC）為4.1%，包封率（EE）為63%，表明該聚合物膠束能有效包裹疏水性藥物。

利用動態(tài)光散射測試了PPEGMA-b-PtBMA組裝膠束的尺寸及其分布范圍。對于PPEGMA-b-PtBMA所形成的膠束，未載藥前膠束的直徑大約為130 nm，載藥后膠束的平均直徑約210 nm，如圖4。就載藥前后膠束的粒徑進行對比，載DOX后粒徑明顯增大，表明膠束空腔內(nèi)能包裹一定量的DOX。

采用透射電子顯微鏡（TEM）對膠束的形貌進行觀察，從PPEGMA-b-PtBMA載DOX膠束的TEM圖像（圖5）可以觀察到，載藥膠束總體呈球形，尺寸大約為200 nm。可見，TEM表征結(jié)果大概與動態(tài)光散射的粒徑表征一致。

圖4 PPEGMA-b-PtBMA膠束的粒徑分布

2.4 DOX的體外釋放性能研究

DOX的體外釋放行為以pH=7.4的磷酸鹽緩沖溶液和pH=4.0的磷酸鹽緩沖溶液作為釋放介質(zhì)，在37℃模擬體溫下進行。從圖6可見，在酸性條件下，DOX的釋放率較快，24 h的藥物釋放量可達76%。而在中性環(huán)境下，DOX的釋放速率明顯減慢，24 h的釋放率僅為37%。由于載藥膠束在不同pH環(huán)境下其藥物釋放量差距較大，初步推斷此聚合物膠束具有pH敏感性。在pH=7.4的環(huán)境下（相當于人體的正常體內(nèi)環(huán)境），藥物的釋放緩慢，有利于藥物在體內(nèi)的循環(huán)，降低藥物的使用劑量，減少藥物對人體的副作用。而在pH=4.0的環(huán)境下（相當于人體腫瘤部位的所處環(huán)境），藥物快速釋放，有利于在短時間內(nèi)作用于病患位置，減少治療時間。

圖5 PPEGMA-b-PtBMA載DOX膠束的TEM圖像

圖5 PPEGMA-b-PtBMA載DOX膠束的體外釋放曲線

3 結(jié)論

本文通過設計合成一種pH響應兩親性兩嵌段的聚合物PPEGMA-b-PtBMA，使其在水溶液中發(fā)生自組裝成核-殼結(jié)構，并進一步研究其載藥及藥物釋放性能，認定該聚合物符合難溶性藥物遞送的用途。通過原子轉(zhuǎn)移自由基聚合（ARGET ATRP）合成了該嵌段共聚物，并用核磁共振對聚合物的化學結(jié)構進行了表征。使用熒光探針技術計算其CMC非常低，說明膠束穩(wěn)定性良好。采用透析法制備PPEGMA-b-PtBMA空白及載藥膠束，并使用透射電鏡、激光粒度儀觀測膠束的粒徑大小及形貌，空白膠束粒徑大約130 nm，載藥膠束粒徑大約210 nm，形狀為球形。載藥膠束具有pH敏感性，在pH值4.0條件下的釋放速率明顯高于pH值7.4條件下的釋放速率，說明該膠束可快速作用于病患位置。這種粒徑小，具有pH敏感性，通過活性基聚合，生物降解性良好的納米級載藥膠束，為研發(fā)新一代的納米級載藥膠束提供了理論基礎及技術指導。