袁孔現(xiàn) 詹三華 范潔 王秀

氯吡格雷(Clopidogrel)為噻吩并吡啶類抗血小板藥，用于血栓栓塞性疾病的治療，臨床作為急性冠狀動(dòng)脈綜合征(ACS)患者經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入(PCI)治療的藥物控制基礎(chǔ)，防止手術(shù)期間出現(xiàn)血小板功能異常、血栓性閉塞情況。氯吡格雷主要通過抑制ADP介導(dǎo)的血小板聚集反應(yīng)發(fā)揮作用。在臨床PCI術(shù)中推薦使用氯吡格雷與阿司匹林相配合的表現(xiàn)效果較好且患者耐受性好[1]。氯吡格雷口服后吸收快速但不完全，吸收率>50%。氯吡格雷吸收后廣泛經(jīng)肝臟代謝，其中約85%經(jīng)酯酶水解為羧酸氯吡格雷，約15%代謝為具有抑制血小板作用的活性代謝物。氯吡格雷與羧酸氯吡格雷可使用合適方法進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)[2-4]。氯吡格雷常見不良反應(yīng)有胃腸道損害、中性粒細(xì)胞減少，腹痛等，偶有血小板減少性紫癜，極少有致死及血惡液質(zhì)反應(yīng)。本文希望通過檢測(cè)血液中氯吡格雷，特別是羧酸氯吡格雷濃度，對(duì)氯吡格雷不良反應(yīng)發(fā)生作一相關(guān)性推斷，為臨床合理用藥提供依據(jù)，減少藥物不良反應(yīng)的發(fā)生。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)準(zhǔn)品與試劑 氯吡格雷化學(xué)對(duì)照品(Clopidogrel,European Pharmacopoeia Reference Standard,ID:001C8D)， 羧酸氯吡格雷化學(xué)對(duì)照品(Clopidogrel Carboxylic Acid,Vaughan Ontario L4K 4C7 Canada,Lot:1427-057A5),艾司唑侖化學(xué)對(duì)照品(Estazolam，國(guó)家麻醉品實(shí)驗(yàn)室，1218-9802)。甲醇、乙腈、甲基叔丁基醚均為色譜純(美國(guó)TEDIA公司)，KH2PO4和H3PO4為分析純?cè)噭疄?.45 μm微孔濾膜過濾注射用水。空白血漿由本院血庫(kù)提供的健康獻(xiàn)血者血漿。

1.2 儀器 日本島津高效液相色譜儀，包括LC-20AD四元泵、DGU-20A5在線脫氣機(jī)、SPD-20AV紫外檢測(cè)器、CTO-20A可調(diào)柱溫恒溫箱及LC solution色譜工作站。萬(wàn)分之一電光分析天平(上海天平儀器廠)、800D電動(dòng)離心機(jī)(常州醫(yī)科諾儀器有限公司)、MDF-382E超低溫冰箱(日本三洋電機(jī)生物醫(yī)學(xué)有限公司)、電熱恒溫水浴鍋(上海躍進(jìn)醫(yī)療儀器廠)。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 精密稱取氯吡格雷化學(xué)對(duì)照品1.10 mg，用甲醇定容至50.0 ml，配制成含氯吡格雷22.0 mg/L的對(duì)照品貯備液。精密稱取羧酸氯吡格雷化學(xué)對(duì)照品1.20 mg，用甲醇定容至50.0 ml，配制成含羧酸氯吡格雷24.0 mg/L的對(duì)照品貯備液。精密稱取艾司唑侖化學(xué)對(duì)照品2.50 mg，用甲醇定容至25.0 ml，配制成含艾司唑侖100.0 mg/L的內(nèi)標(biāo)溶液。

1.4 樣品預(yù)處理 服用氯吡格雷一周的患者空腹血漿500 μl加至15 ml具塞錐底玻璃離心管中，精密加入內(nèi)標(biāo)溶液10 μl，渦旋振搖30 s，加入甲基叔丁基醚5 ml，密塞，渦旋振搖3 min。于離心機(jī)中以4 000 r/min轉(zhuǎn)速離心4 min，靜置后移取上清液至10 ml玻璃管中，于恒溫水浴鍋中65℃水浴，于N2流中吹干。進(jìn)樣前加50 μl流動(dòng)相快速振搖數(shù)秒溶解樣品，吸取20 μl進(jìn)樣。

1.5 色譜分析條件 色譜柱采用KromasilTM 100A C18色譜柱(150 mmlD×4.6 mmID,5 μm)，流動(dòng)相為10 mmol/L KH2PO4溶液(含0.25% H3PO4)∶乙腈(50 ∶50)，流速為1.0 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm，柱溫40℃。

1.6 方法專屬性 分別取標(biāo)準(zhǔn)溶液、空白血漿、空白血漿+標(biāo)準(zhǔn)品、樣品血漿經(jīng)預(yù)處理后進(jìn)樣檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)羧酸氯吡格雷保留時(shí)間為1.8 min、艾司唑侖保留時(shí)間為4.2 min、氯吡格雷保留時(shí)間為7.4 min，基本無雜質(zhì)峰干擾。實(shí)驗(yàn)顯示樣本中羧酸氯吡格雷、艾司唑侖、氯吡格雷能得到完全分離且與各化學(xué)對(duì)照品保留時(shí)間一致，在此實(shí)驗(yàn)條件下所測(cè)得結(jié)果可以代表原藥濃度。見圖1。

ABCD

圖1氯吡格雷和羧酸氯吡格雷HPLC色譜圖；A 標(biāo)準(zhǔn)品色譜，B 空白血漿色譜，C 空白血漿+標(biāo)準(zhǔn)品色譜，D 樣本血漿色譜;峰1羧酸氯格雷；峰2 氯吡格雷；峰3 內(nèi)標(biāo)

2 結(jié)果

2.1 線性關(guān)系 取錐底試管15 ml×18支，10 ml×19支。在15 ml試管中分別加入等量?jī)?nèi)標(biāo)溶液、不同量標(biāo)準(zhǔn)品溶液，再加入空白血漿500 μl混勻，配制成含羧酸氯吡格雷+氯吡格雷濃度分別為(0.12±0.11)、(0.24±0.22)、(0.48±0.44)、(0.96±0.88)、(1.92±1.76)、(3.84±3.52)mg/L的標(biāo)準(zhǔn)濃度溶液，每式3份。按“1.4”項(xiàng)樣品預(yù)處理方法操作，取20 μl進(jìn)樣，計(jì)算各物質(zhì)與內(nèi)標(biāo)物峰面積比值，參照標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積比值計(jì)算各物質(zhì)濃度。以理論濃度值(X)與實(shí)測(cè)濃度值(Y)作線性回歸，得到氯吡格雷線性范圍為0.11～3.52 mg/L，回歸方程為Y=1.0725X-0.037(r=0.9994)；羧酸氯吡格雷線性范圍0.12～3.84 mg/L，回歸方程為Y=1.0198X-0.0502(r=0.9984)。取對(duì)照品溶液吹干溶劑，經(jīng)流動(dòng)相稀釋后進(jìn)樣檢測(cè)，按信噪比大于5的要求，最低檢測(cè)限羧酸氯吡格雷為0.06 mg/L、氯吡格雷為0.055 mg/L。

2.2 回收率 按“1.4”項(xiàng)樣品預(yù)處理方法操作，記錄氯吡格雷、羧酸氯吡格雷與艾司唑侖峰面積比值，與標(biāo)準(zhǔn)濃度對(duì)照品直接進(jìn)樣的峰面積比值對(duì)比，計(jì)算實(shí)測(cè)濃度和提取回收率，氯吡格雷與羧酸氯吡格雷各濃度提取回收率均在85%以上，方法符合生物樣本檢測(cè)要求。見表1。

表1 氯吡格雷、羧酸氯吡格雷提取相對(duì)回收率 n=3

2.3 精密度 取空試管分別加入不同量化學(xué)對(duì)照品溶液和同劑量?jī)?nèi)標(biāo)溶液，并加入0.5 ml空白血漿，使血漿中氯吡格雷濃度分別為0.11、0.55、2.75 mg/L，羧酸氯吡格雷濃度分別為0.12、0.60、3.00 mg/L。按“1.4”項(xiàng)樣品預(yù)處理方法操作，計(jì)算日內(nèi)變異和5 d內(nèi)日間變異，由結(jié)果可知，低、中、高三濃度日內(nèi)及日間RSD均<15%。見表2。

表2 氯吡格雷、羧酸氯吡格雷精密度試驗(yàn) n=5

2.4 患者血樣監(jiān)測(cè) 取在院的ACS患者預(yù)行PCI術(shù)前藥物準(zhǔn)備，即一次性頓服300 mg后4 h采取患者靜脈抗凝血3 ml，按“1.4”項(xiàng)樣品預(yù)處理方法操作，記錄進(jìn)樣后的色譜圖，計(jì)算患者血液中氯吡格雷和羧酸氯吡格雷濃度。見表3。

表3 患者血液樣本中氯吡格雷、羧酸氯吡格雷濃度監(jiān)測(cè)

3 討論

3.1 實(shí)驗(yàn)方法優(yōu)化 本實(shí)驗(yàn)建立了血漿中氯吡格雷和羧酸氯吡格雷的RP-HPLC檢測(cè)方法，氯吡格雷保留時(shí)間7.4 min，線性范圍0.11～3.52 mg/L；羧酸氯吡格雷保留時(shí)間1.8 min，線性范圍0.12～3.84 mg/L。兩者提取回收率均>85%，日內(nèi)、日間RSD<15%，符合生物樣品分析要求，可用于臨床藥物治療監(jiān)測(cè)。

加樣回收實(shí)驗(yàn)中，通過對(duì)比，發(fā)現(xiàn)甲基叔丁基醚提取效果與正戊烷和乙酸乙酯[3]相當(dāng)，帶入干擾雜質(zhì)較少，實(shí)驗(yàn)滿意度較好?；颈ＷC了實(shí)驗(yàn)的成功并保證了色譜柱的安全使用。

對(duì)流動(dòng)相的選擇與優(yōu)化，本研究比較了不同系統(tǒng)和成分比例的的流動(dòng)相對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響[5]，最終確定使用10 mmol/L KH2PO4/H2O(水相)—CH3CN(有機(jī)相)按50∶50混合的流動(dòng)相。流動(dòng)相中水相和有機(jī)相分別配制和裝瓶，并經(jīng)超聲脫氣，用前經(jīng)四元泵按比例抽取混和。水相與有機(jī)相以合適比例混合可以保證儀器的正常運(yùn)行，不產(chǎn)生過高的柱壓，并優(yōu)化峰形，減少拖尾。水相中用H3PO4調(diào)節(jié)酸度，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)H3PO4用量對(duì)實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生較大影響。合適的H3PO4含量可以優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果，使氯吡格雷保留時(shí)間縮短，同時(shí)又稍許延長(zhǎng)羧酸氯吡格雷保留時(shí)間，降低雜質(zhì)干擾。

檢測(cè)波長(zhǎng)選擇220 nm，是根據(jù)氯吡格雷和羧酸氯吡格雷吸收波長(zhǎng)掃描結(jié)果，發(fā)現(xiàn)兩者在190～225 nm波段存在吸收，經(jīng)比較選擇220 nm波長(zhǎng)作為檢測(cè)波長(zhǎng)，在此波長(zhǎng)處兩者和艾司唑侖均有較好吸收，能保證檢測(cè)結(jié)果。

3.2 氯吡格雷藥理作用 氯吡格雷為噻吩并吡啶類衍生物，本身為并無活性的前體藥物。原藥經(jīng)吸收后85%通過酯酶水解為羧酸氯吡格雷，15%在肝臟細(xì)胞色素P450酶系統(tǒng)作用下代謝為具有抑制血小板作用的活性代謝物[6]。由于CYP2C19基因多態(tài)性的原因，氯吡格雷治療后的臨床療效存在明顯的個(gè)體差異，患者在應(yīng)用常規(guī)劑量氯比格雷后血小板功能不能得到有效抑制，從而發(fā)生急性或亞急性臨床缺血事件，稱為氯吡格雷治療相關(guān)的血小板高反應(yīng)性(HTPR)[7]或氯吡格雷抵抗(CR)[8]，是冠狀動(dòng)脈PCI術(shù)后血栓事件和腦卒中再發(fā)的主要危險(xiǎn)因素。

羧酸氯吡格雷無抑制血小板作用，但是具有胃腸道損害作用，是使用氯吡格雷引起胃腸道不良反應(yīng)的主要原因，尤其是當(dāng)增加氯吡格雷用藥劑量以圖避免氯吡格雷抵抗時(shí)更易出現(xiàn)胃腸道損害[9]。

3.3 氯吡格雷和羧酸氯吡格雷監(jiān)測(cè)的意義 氯吡格雷作為原藥，經(jīng)消化道吸收后迅速代謝轉(zhuǎn)化。氯吡格雷原藥在血液中濃度極低[10]，使用RP-HPLC紫外檢測(cè)器檢測(cè)氯吡格雷血漿藥物濃度較為困難，且該藥物為前體藥物[11]，濃度監(jiān)測(cè)意義不明顯；氯吡格雷硫醇衍生物與血小板ADP受體不可逆性結(jié)合，血漿半衰期僅30 min，分離提取困難，也無法檢測(cè)血液中濃度[12]。硫醇衍生物藥理作用效果可通過血小板功能檢測(cè)來確定[13]；通過測(cè)定血栓彈力圖也可以在一定程度上評(píng)價(jià)大動(dòng)脈粥樣硬化患者的血小板反應(yīng)性，并且可以在一定程度上預(yù)測(cè)腦梗死的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)[14]。

服用氯吡格雷的患者，羧酸氯吡格雷在血液循環(huán)中具有較高濃度，羧酸氯吡格雷半衰期約為7～8 h[15]，可通過實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行檢測(cè)，且血漿羧酸氯吡格雷最大濃度及AUC與服用劑量成線性關(guān)系[16]。本文希望通過監(jiān)測(cè)血漿中羧酸氯吡格雷濃度與胃腸道損害反應(yīng)之間建立相關(guān)性聯(lián)系，當(dāng)血漿中羧酸氯吡格雷穩(wěn)態(tài)濃度高于安全值時(shí)及時(shí)向臨床發(fā)出警示，避免出現(xiàn)胃腸道損害，保證氯吡格雷安全、合理使用。

氯吡格雷具有抑制血小板聚集的作用，由于CYP2C19基因多態(tài)性的原因，其治療效果存在較大個(gè)體差異。部分患者在應(yīng)用氯吡格雷治療時(shí)存在所謂的氯吡格雷抵抗(CR)，在正常劑量使用時(shí)存在較大的心血管不良事件發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，而在加大使用劑量降低心血管不良事件發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)時(shí)卻又可能使出血事件發(fā)生概率增大[17]。臨床應(yīng)加強(qiáng)對(duì)使用氯吡格雷患者的監(jiān)測(cè)，以減少其心血管不良事件發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)、降低出血事件發(fā)生概率。本研究通過實(shí)驗(yàn)方法學(xué)考察，建立了使用高效液相色譜法檢測(cè)血漿中氯吡格雷和氯吡格雷羧酸的實(shí)驗(yàn)方法。該實(shí)驗(yàn)方法可快速、簡(jiǎn)便地檢測(cè)服用氯吡格雷的患者血漿中氯吡格雷和羧酸氯吡格雷兩種物質(zhì)的濃度，為保障患者用藥安全，減少藥物不良反應(yīng)的發(fā)生提供有關(guān)治療藥物監(jiān)測(cè)的藥學(xué)服務(wù)。